5. Осаждение белков солями тяжелых металлов

При действии небольших концентраций солей тяжелых металлов (Рb⁺², Аg⁺¹, Аs⁺³, Нg⁺², Сd⁺², Вi⁺³и т.д.) на растворы белка происходит денатурация белковых молекул. Осаждение денатурированного белка обусловлено адсорбцией иона тяжелого металла на поверхности белковой молекулы и образованием не растворимых в воде комплексных соединений. Кроме того, тяжелые металлы нейтрализуют электрический заряд и изменяют четвертичную, третичную и вторичную структуры макромолекул белка, образуя связи между функциональными группами молекул.

Существуют определенные границы концентраций солей тяжелых металлов, при которых комплекс белка с солью тяжелого металла переходит в осадок либо находится в растворимом состоянии.

Ход работы.К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 1%-ного раствора сульфата меди. Выпадает осадок, который растворяется в избытке (7-10 мл) раствора этой соли.

Результаты наблюдений заносят в таблицу 2.

Таблица 2  Результаты наблюдений

Исследуемый материал	Денатурирующий фактор и его воздействие	Наблюдения

Материалы и реактивы:раствор яичного альбумина 1% (см. приложение Б, п.4); 10%-ный раствор уксусной кислоты; 10%-ный растворNаОН; 96%-ный этиловый спирт;80%-ный ацетон;концентрированные кислоты Н₂SO₄, НСl, НNО₃;1%-ный раствор сульфата меди;10%-ный раствор ТХУ; насыщенный растворNаСI.

Оборудование:пробирки обыкновенные; пипетки на 1–2 мл; спиртовка.

Контрольные вопросы

1.Что такое денатурация белка?

2. Какие Вы знаете денатурирующие факторы и каков механизм их действия?

3. Какие структуры белковых молекул изменяются при денатурации?

4. Является ли денатурация обратимым процессом?

4. Разделение и очистка белков методом диализа

Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупронецаемых мембран. Белковые молекулы, обладая большой молекулярной массой, не способны проникать через полупронецаемые перегородки (искусственные и естественные мембраны). При этом низкомолекулярные частицы (органические и неорганические) легко проходят через поры полупроницаемых мембран.

Диализ широко используется для очистки белков от низкомолекулярных примесей (соли, сахара и других), которые легко проходят через поры полупроницаемых мембран. Прибор, в котором проводят диализ, называется диализатором. Целлофановый или коллодиевый мешочек, опущенный в сосуд с водой, представляет простейший диализатор (рис.1). Белок, помещенный в мешочек, остается в нем, а низкомолекулярные вещества диффундируют через мембрану в воду.

Методом диализа можно разделить альбумины и глобулины. При переходе солей из белкового раствора в окружающую среду глобулины будут выпадать в осадок, т.к. они не растворимы в водной среде, а альбумины будут оставаться в растворе. Простейшим диализатором может служить целлофановый мешочек, опущенный в стакан с водой. Солевой раствор белка помещают в мешочек, при этом молекулы низкомолекулярных веществ (ионы соли) диффундируют через стенку мешочка, а крупные молекулы белка остаются внутри мешочка.

Белок +

(NН₄)₂SО₄

2 NН₄⁺ SО₄^2-

Н₂О

Рисунок 1Схема диализатора

Ход работы. 10–15 мл раствора яичного белка, содержащего альбумины, глобулины и сульфат аммония, помещают в целлофановый мешочек и погружают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы уровень жидкости в мешочке совпадал с уровнем воды. Для ускорения диализа необходимо менять воду в сосуде. Через 1 час анализируют воду из стакана: в одной пробирке проводят биуретовую реакцию и убеждаются, что белки через мембрану не проходят; в другой пробирке проводят реакцию на ион SO₄^2-, добавлением нескольких капель 10%-ного раствора ВаСI₂для установления проникновения соли через стенку целлофанового мешочка. Через 2–3 часа отмечают появление осадка глобулинов внутри мешочка, который отфильтровывают. В фильтрате остаются белки альбуминовой фракции.

Глобулиновую природу белков осадка доказывают растворением его в растворах солей (10%-ный раствор хлористого аммония, хлористого натрия и др.) При разбавлении раствора водой вновь выпадает осадок.

Альбуминовую природу белков фильтрата подтверждают разбавлением водой с отсутствием осадка или полным насыщением сернокислым аммонием (выпадает осадок).

Материалы и реактивы:раствор яичного белка, содержащего альбумины, глобулины и сульфат аммония (см. приложение Б, п.5); 10%-ный раствор хлористого бария; 10%-ный раствор едкого натра; 1%-ный раствор медного купороса; 10%-ный раствор хлористого аммония; сернокислый аммоний, тонко измельченный.

Оборудование: пробирки обыкновенные; целлофановый или коллодиевый мешочек; химический стакан или сосуд на 1–2 мл;пипетки мерные на 10 мл; пипетки.

Контрольные вопросы

1. Принцип процесса диализа.

2. Устройство простейшего диализатора.

3. Для каких целей применяется диализ?

4. Почему методом диализа можно отделить глобулины (солерастворимые белки) от глобулинов (водорастворимые белки)?

5. Как доказать глобулиновую и альбуминовую природу белков при их разделении?

6. Реакции, используемые для доказательства протекания процесса диализа.