Вопрос 14

Методы выделения и очистки белков.

Выделение белков:

Из ткани: гомогенизация (разрушение тканей и клеточных структур)

Из плазмы крови, мочи и др. биологических жидкостей гомогенизация не нужна

– осаждение белков (солями, спиртом или дегидратирующими растворами)

– фракционирование белков (ионообменная или гельпроникающая хроматография) Очистка. Существует много методов, рассмотрим детально гельфильтрацию и диализ.

Разделение белков по молекулярной массе (метод молекулярных сит) или отделение белков от низкомолекулярных веществ обычно ведут при помощи гельфильтрации. При гельфильтрации первыми из колонки выходят белки (или вещества) с большей молекулярной массой, которые не заходят в середину гранул, а позже из колонки выходят вещества з небольшой молекулярной массой, которые застревают в порах геля.

Диализ – это метод очистки белков от низкомолекулярных примесей. Маленькие молекулы проходят через полупроницаемую мембрану, а белки, имеющие большую молекулярную массу не проходят через нее.

Количественное определение белков. Количество белка можно определять: 1) по содержанию в них азота (для этого белковый препарат сначала подвергают минерализации, а затем определяют содержание азоту по реакции Несслера); 2) биуретовый метод – основан на образовании окра шенных в синефиолетовый цвет комплексов между ионами меди и пептидными связями белков;

3) метод Лоури, который основан на способности медных комплексов белков восстанавливать реактив Фолина; 4) метод Бредфорда, который основан на способности белков связывать краси тели – бромфеноловый синий, кумасси голубой; 5) на кафедре разработан метод определения белков по их взаимодействию с коллоидным раствором высокодисперсного кремнезема.

Качественное определение белков используются осадочные пробы с органическими кислотами (трихлоруксусная, сульфосалициловая кислоты), цветные реакции на определенные аминокислоты в составе белка (реакция Фоля, ксантопротеиновая реакции и др).

Вопрос 9

Белки масличных культур

У масличных семян основной запасающей тканью для белков и ли-пидов является паренхима семядолей (подсолнечник, хлопчатник, рапс), эндосперм (семена клещевины, кориандра) или одновременно паренхима семядолей и эндосперм (хлопчатник, лен). Запасные белки сосредоточены в простых алейроновых зернах (семена хлопчатника, рапса, горчицы) и сложных (подсолнечник, клещевина). Простые алейроновые зерна не содержат посторонних соединений, тогда как сложные включают белковую и небелковую части. Сложные алейроновые зерна подразделяются на два типа: зерна, содержащие глобоиды - К, Mg, Са-соли инозитфосфорной кислоты, и зерна, в состав которых входят глобоиды и кристаллоиды. Кристаллоиды расположены в центре алейроновых зерен и окружены аморфной белковой зоной. Алейроновое зерно имеет вакуольную природу, вокруг него сосредоточены липи-ды, находящиеся в клетке, покрытой клеточной оболочкой (рис. 2.15). На долю белка в составе сухой массы алейроновых зерен приходится 60-80% общего белка семени.

Содержание белков в семенах масличных культур составляет 14-37% на сухое вещество. В семенах подсолнечника белок содержится в количестве 15%, в ядре - 16-19%, семенах арахиса - 20-37%, конопли - 20-22%, рапсе - 25-26%, в ядрах клещевины - 18-20%, в ядрах хлопчатника - 34-37%. В белках семян масличных культур содержится 10-30% альбуминов и до 90% глобулинов. Белки алейроновых зерен (алейрины) представлены в основном глобулинами (80-97%) и незначительным количеством альбуминов и глютелинов (1-2%). Проламины в алейроновых зернах практически отсутствуют. Кристаллоид масличных культур (конопли - эдестин, клещевины, хлопчатника, мака) представляет собой также глобулины с молекулярной массой от 15 до 300 кД и выше. В небольших количествах в нем присутствуют минорные компоненты с молекулярной массой около 600 кД. Глобулины, как и альбумины, являются смесью индивидуальных белков. В табл. 2.9 приведены состав и молекулярные характеристики фракций глобулинов. 7S фракция глобулинов масличных семян, как и у бобовых, называется вицилином, 11S - легумином. Все фракции

Белки бобовых культур

Основную часть семядолей бобовых культур (сои, гороха, фасоли, вики) составляют запасные белки, являющиеся в соответствии с классификацией Осборна глобулинами. Кроме того, в семенах содержится небольшое количество альбуминов, которые не являются запасными белками. В качестве самостоятельной группы в семядолях не обнаружены глютелины. Извлекаемые щелочью белки также представляют собой глобулины, но они находятся во взаимодействии с полисахаридами. Общее содержание белка в бобовых культурах высокое и составляет 20-40% от общей массы.

Из суммарного солевого белкового экстракта осаждением сернокислым аммонием выделяют два основных глобулиновых компонента, получившие название вицилина и легумина. С учетом значений констант седиментации (см. Качественное и количественное определение белка) у сои, вики, гороха и других культур их называют 7S и 1 IS белками, соответственно. Оба эти вида белков обладают сложной четвертичной структурой, которая определяет их функции и свойства. Диссоциация 11S белков семян на субъединицы обнаружена еще в 30-е гг. Сведбергом и Пе-дерсеном, но более детально она изучена позднее. Установлено, что 1 IS белки семян бобовых диссоциируют сначала на 7S субъединицы, затем на субъединицы с коэффициентом седиментации 2-3S. Диссоциация 11S белков протекает ступенчато по схеме: