Мікробіологія шигельозу-методичка

ПРАКТИЧНЕ ЗАНЯТТЯ № 22 МІКРОБІОЛОГІЯ ШИГЕЛЬОЗУ

Мета заняття (загальна) – уміти проводити мікробіологічну діагностику шигельзу та оцінювати його результати.

ТЕОРЕТИЧНІ ПИТАННЯ

1.Біологічні особливості збудників шигельозу.

2.Мікробіологічна діагностика шигельозу (заповнення карти програмованого контролю).

3.Епідеміологія та патогенез шигельозу. Особливості імунітету при шигельозі.

4 Принципи профілактики та лікування шигельозу.

ЛІТЕРАТУРА:

1.Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Под ред. Л.Б.Борисова и А.М.Смирновой.

– М.: Медицина, 1994 - С. 280283.

2.Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією: Підручник / Пер. з рос. В.В.Клінченка. – К.: Вища шк., 1992. – С. 172-180.

3.Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. – М., Медицина, 1981. – С. 270-273.

4.Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія: Посібник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2004. - С.209-212.

5.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: Учебник / Под ред. А.А. Воробьева. – М. Медицинское информационное агентство, 2004. - С.360-362.

6.Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология – М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2002. – С.385-389.

Методичні рекомендації студенту по виконанню практичної роботи

1. Особливості посіву досліджуваного матеріалу від хворого з ознаками шигельозу.

Студент повинен запам‘ятати, що на першому етапі бактеріологічної діагностики шигельозу використовують диференціально-діагностичні середовища Левіна, Плоскирєва (для отримання ізольованих колоній) та збагачувальне середовище - селенітовий бульйон (з метою накопичення шигел).

2. Демонстрації:

2.1. Культуральні властивості бактерій роду Shigella на середовищах Левіна та Плоскирєва.

Студент повинен звернути увагу на те, що на середовищах Левіна та Плоскірева мікроорганізми утворили безбарвні (лактозонегативні) дрібні (1-1½мм) круглі блискучі напівпрозорі опуклі колонії.

При вивченні демонстрації студент повинен зробити висновки:

1/ на середовищах Левіна та Плоскирєва вивчаються культуральні властивості шигел; 2/ різні види шигел не розрізняються за культуральними властивостями і утворюють безбарвні

(лактозонегативні) колонії.

2.2. Мікроскопія мікропрепаратів "S.flexneri 2a", "S.sonnei" та "E.coli О55:К59:Н1"

При вивченні мікропрепаратів, які пофарбовані за методом Грама, студент повинен пересвідчитися у тому, що S.flexneri 2a та S.sonnei являють собою прямі грамнегативні монобактерії, які за морфологічними та тинкториальними властивостями не відрізняються від E.coli О55:К59:Н1 та на підставі цього зробити висновок: різні види шигел та кишкові палички не розрізняються між собою за морфологічними та тинкториальними властивостями. Це вказує на недоцільність використання бактеріоскопічного методу для ідентифікації збудників шигельозу та ешерихіозу.

2.3. Реакція аглютинації на склі з шигельозною аглютинуючою полівалентною сироваткою

Студент повинен побачити утворення аглютинату, який утворений досліджуваною культурою та полівалентною аглютинуючою шигельозною сироваткою, яка містить специфічні антитіла до антигенів Shigella flexneri 1-6 та Shigella sonnei (S.flexneri та S.sonnei є найбільш поширеними збудниками

шигельозу) і зробити висновок, що культура, яка утворила лактозонегативні колонії на середовищі Левіна чи Плоскирєва є S.flexneri або S.sonnei.

Студент повинен запам‘ятати, що серологічна ідентифікація виділеної культури проводиться за допомогою реакції аглютинації на склі спочатку з полівалентними, а потім з моновидовими (для

1

визначення виду збудника), типовими (для визначення серовару збудника) та груповими (для визначення підсеровару збудника) аглютинуючими сироватками. Результати серологічної ідентифікації збудника мають вирішальне значення для визначення серовару (підсеровару) бактерії у порівнянні з вивченням його біохімічних властивостей.

2.4. Ріст шигели на середовищі Олькеницького

Студент на підставі знань про те, що S.flexneri ферментує глюкозу з утворенням кислоти та газу (про що свідчить зміна кольору середовища та утворення розривів середовища тільки у стовпчиковій частині середовища Олькеницького), S.sonnei повільно ферментує глюкозу, лактозу та сахарозу з утворенням кислоти (відбувається зміна кольору всього середовища), а S.dysenteriae та S.boydii ферментують тільки глюкозу з утворенням кислоти, повинен припустити, що культура, яка культивована на середовищі Олькеницького, є S.flexneri.

2.5.1. Цукролітичні та протеолітичні властивості шигел на середовищах

Гісса

При вивченні біохімічних властивостей досліджуваної культури студент повинен підтвердити, що на середовищах Гісса та на пептонній воді культивовано S.flexneri. З цією метою студент оцінює характер ферментації збудником глюкози (№1), лактози (№2), мальтози (№3), дульцину (№5), сахарози (№6), наявність ферменту каталази та утворення індолу (№7), порівнюючи отримані результати з даними, наведеними у таблиці 1.

Першочергово студент повинен звернути увагу на характер ферментації маніту (№4): всі види шигел, окрім S.dysenteriae, ферментують маніт. Студент повинен знати, що: а/ особливістю S.flexneri є те, що даний вид шигел ферментує глюкозу з газоутворенням, варіабельно ферментує дульцит, але не утворює індол та не має ферменту каталазу; б/ S.sonnei повільно (через 48-72 години) ферментує лактозу, глюкозу, сахарозу з утворенням кислоти, має фермент каталазу, не ферментує дульцит та не утворює індол; в/ S.dysenteriae постійно ферментує тільки глюкозу з утворенням кислоти, а S.boydii ─ постійно ферментує глюкозу з утворенням кислоти та варіабельно утворює індол.

Вивчивши біохімічні властивості запропонованої студенту культури (мікроорганізм ферментує маніт, глюкозу ферментує до кислоти та газу, лактозу та сахарозу не ферментує, не утворює індол, не має ферменту каталази), він робить висновок, що культура, яка досліджується, є S.flexneri.

2.6. Серодіагностика шигельозу: РНГА з парними сироватками

Для підвищення ефективності серологічної діагностики шигельозу кров хворого беруть двічі (парні сироватки) з інтервалом у 7-10 днів і РНГА ставлять з кожною із них1. Діагностичне значення має факт зростання титру антитіл у другій порції сироватки, у порівнянні з першою, у 4 і більше разів. При отриманні такого результату робиться висновок, що людина хвора на шигельоз.

1 Аглютиніни до деяких видів шигел можуть з‘являтися в низьких титрах у здорових людей. У зв‘язку з індивідуальними особливостями імунного статусу у людини можливе зниження реактивності організму і, як наслідок, титр антитіл у таких хворих буде нижче діагностичного. Такі обставини перешкоджають об‘єктивній оцінці результатів реакції непрямої (пасивної) гемаглютинації, поставленій з сироваткою крові хворого.

2

Студент, вивчаючи на планшетці РНГА з парними сироватками та еритроцитарним діагностикумом Флекснера, бачить зростання титру антитіл у 3 рази і робить висновок, що людина хвора на шигельоз Флекснера.

3.1. Діагностичні препарати для ідентифікації шигел за антигенними властивостями:

Шигельозна адсорбована аглютинуюча полівалентна сироватка.

Діагностичний препарат, який містить специфічні антитіла до антигенів Shigella flexneri 1-6 та

Shigella sonnei ─ при взаємодії специфічних антитіл з відповідними антигенами шигел відбувається утворення аглютинату. Аглютинуюча сироватка отримана шляхом гіперімунізації кроликів сумішшю сероварів Shigella flexneri 1-6 та Shigella sonnei (на сьогодення це найбільш поширені збудники шигельозу) з наступною адсорбцією міжгрупових та інших неспецифічних антитіл. Використовується для постановки реакції аглютинації на склі при бактеріологічному методі дослідження культури з метою ідентифікації шигел від сальмонел та ЕІЕС, які також на середовищах Плоскірева та Левіна утворюють лактозонегативні колонії.

Адсорбована аглютинуюча типова (сероварспецифічна) сироватка до шигели Флескнера (тип

ІІ).

Діагностичний препарат, який містить специфічні антитіла до типового антигену ІІ Shigella flexneri

– при взаємодії специфічних антитіл з типовим антигеном ІІ S.flexneri відбувається утворення аглютинату. Аглютинуюча сироватка отримана шляхом гіперімунізації кроликів антигеном S.flexneri тип ІІ з наступною адсорбцією інших антитіл. Використовується для постановки реакції аглютинації на склі при бактеріологічному методі дослідження культури з метою визначення серовару S.flexneri (серовар штаму - S.flexneri 2).

Адсорбована аглютинуюча групова 3,4 сироватка Shigella flexneri.

Діагностичний препарат, який містить специфічні антитіла до групового антигену 3,4 Shigella

flexneri – при взаємодії специфічних антитіл з груповим антигеном 3,4 S.flexneri відбувається утворення аглютинату. Аглютинуюча сироватка отримана шляхом гіперімунізації кроликів антигеном S.flexneri групи 3,4 з наступною адсорбцією інших антитіл. Використовується для постановки реакції аглютинації на склі при бактеріологічному методі дослідження культури з метою визначення підсеровару S.flexneri (підсеровар

- S.flexneri 2а).

Люмінесцентні шигельозні сироватки.

Мета застосування препарату – діагностична – по відомому антитілу, яке мічене флюорохромом, визначається невідомий антиген. Препарат являє собою специфічні антитіла до певного виду чи серовару шигел, які кон‘юговані з флюорохромом (ізотіоцианатом флюоресцеїном). При утворенні комплексу шигела ─ специфічне антитіло, що мічене флюорохромом, спостерігається його світіння при люмінесцентній мікроскопії (пряма реакція Кунса). Препарат застосовується для прискореного встановлення збудника шигельозу у матеріалі від

хворого, харчових продуктах та воді (метод експрес-діагностики) або при бактеріологічному методі дослідження збудника шигельозу (з культурою, яка культивована у середовищі для накопичення мікроорганізму).

3.2.Діагностичні препарати для серодіагностики шигельозу

Шигельозний діагностикум Зонне Діагностичний препарат, який містить завісь інактивованих шигел Зонне – при їх взаємодії зі

специфічними антитілами у сироватці хворого на шигельоз Зонне відбувається утворення аглютинату. Препарат використовується у розгорнутій реакції аглютинації (РРА) по типу Відаля для визначення титру специфічних антитіл в сироватці хворого на шигельоз Зонне (серологічний метод діагностики).

 Шигельозний еритроцитарний діагностикум Зонне.

Діагностичний препарат, який являє собою завісь еритроцитів барана з адсорбованими на їх поверхні S.sonnei. Препарат використовується для виявлення специфічних антитіл до S.sonnei у сироватці хворого на шигельоз та осіб з атиповою формою шигельозу (серологічний метод діагностики) за допомогою реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) з парними сироватками. S.sonnei, що навантажені на еритроцити барана, аглютинують зі специфічними антитілами у сироватці хворого та утворюють "пухкий" аглютинат з нерівним фестончатим краєм (у вигляді перевернутої "парасольки") на дні пробірок або лунок.

3.3. Бактеріофаг шигельозний полівалентний (рідкий)

Діагностичний препарат, який містить стерильний фільтрат фагів, які лізують шигели Флекснера та Зонне. Використовується для фаготипування виділеної чистої культури шигел (для підтвердження належності виділеної чистої культури до роду Shigella).

3.4. Препарати, які використовуються для лікування шигельозу та корекції нормальної мікрофлори кишечнику

3

Бактеріофаг шигельозний полівалентний (таблетований).

Лікувально-профілактичний препарат містить стерильний фільтрат бактериофагів, які лізують

шигели Флекснера сероварів 1-6 та шигели Зонне. Випускається у вигляді таблеток з кислотостійким покриттям. Використовується для екстреної профілактики шигельозу та лікування гострого шигельозу.

Лактоглобулін.

Лікувально-профілактичний препарат – являє собою молоко корів, гіперімунізованих шигелами.

Препарат містить sIgA (секреторні імуноглобуліни класу А). Застосовується перорально для лікування хворих на субклінічну форму шигельозу (для створення місцевого імунітету).

Еубіотики - колібактерин, біфідумбактерин, біфікол, лактобактрин.

Лікувально-профілактичні препарати (характеристику препаратів наведено у попередньому

практичному занятті).

Додаток 1

ПОЯСНЕННЯ ДО ТЕМИ: "МІКРОБІОЛОГІЯ ШИГЕЛЬОЗІВ" для самостійної роботи студента

Систематичне			положення		Родина Enterobacteriaceae
збудників шигельозів					Рід Shigella
					Види: S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei.
Основи			Міжнародної		Біохімічні ознаки (які ферментують маніт, які не ферментують маніт,
класифікації шигел.					повільно ферментують лактозу), особливості антигенної структури.
Морфологічні				та	Короткі прямі з заокругленими кінцями грамнегативні нерухливі
тинкториальні			особливості		монобактерії. Спор та капсул не утворюють.
збудників шигельозу
Чи	відрізняються			при	За морфологічними та тинкториальними властивостями не відрізняються,
світловій			мікроскопії		тому	при	мікробіологічній	діагностиці	кишкових	інфекцій
збудники		шигельзу		від	бактеріоскопічний метод не застосовується.
збудників		ешерихіозу		та
сальмонельозу?
Тип дихання шигел					Факультативні анаероби.
Мета		бактеріологічного			1. Діагностика шигельозу. 2. Контроль етіотропного лікування. 3.
дослідження матеріалу.					Виявлення осіб з легкими та субклінічними формами захворювання. 4.
					Контроль за контактними особами. 5. Контроль за працівниками харчової
					промисловості, дитячих закладів, лікарень.
Антигенна			будова		О-антигени різної специфічності: загальні для родини, роду, виду, типу,
збудників шигельозу.					групи. S.sonnei володіє антигеном 1-ї фази, який є К-антигеном. К-антиген
					типу В присутній у S.dysenteriae, S.boydii та S.flexneri 6. Н-антигену у
					шигел немає.
Мета			визначення		Ідентифікація збудника до серовару (S.dysenteriae, S.boydii, S.sonnei) та
антигенної будови шигели.					підсеровару (S.flexneri).
Джерело		інфекції		при	Хворі з маніфестною (особливо у перші 3 дні захворювання),
шигельозі.					невиявленими стертими, субклінічними, легкими формами захворювання,
					що задіяні на підприємствах харчової промисловості, громадського
					харчування, об‘єктах водопостачання. Частіше інфекція уражає дітей у віці
					від 3 місяців до 10 років і захворювання характеризується важким
					перебігом.
Шляхи передачі інфекції.					Водний (переважає при шигельозі Флекснера), харчовий - особливо
					важлива роль належить молоку та молочним продуктам (переважає при
					шигельозі Зонне), контактно-побутовий (особливо для виду S.dysenteriae).
					У молоці та молочних продуктах S.sonnei здатні тривало зберігатися та
					розмножуватися. Комахи-переносники (мухи, таргани) здатні переносити
					збудника на харчові продукти.
Особливості			епідеміології		Зміна видового складу збудників, біотипів S.sonnei та сероварів S.flexneri в
шигельозу.					певних регіонах. Причини зміни видового складу збудників шигельозу,
					напевне, пов‘язані зі зміною колективного імунітету та з зміною
					властивостей шигел.
Методи		мікробіологічної			Основний – бактеріологічний, допоміжний – серологічний. Експрес-методи
діагностики шигельозу					діагностики антигенів: РІФ, РПГА, РЗК – дослідження фекалій та сечі, ІФА

4

					– сироватки крові.
Матеріал,				який	Основний (бактеріологічний) метод ─ фекалії; досліджують блювотні маси,
досліджується				при	промивні води шлунку та кишок, харчові продукти (особливо молоко, сир,
шигельозі.					сметана) при спалахах шигельозу та секційний матеріал (товста кишка,
					мезентеральні лімфатичні вузли, шматочки паренхіматозних органів). При
					підозрі на бактеріємію - кров та сеча. При серодіагностиці – кров.
Середовища				для	Диференціально-діагностичні – Левіна, Плоскирєва. Збагачувальне -
первинного	культивування				селенітовий бульйон.
збудника
Культуральні			властивості		Колонії безбарвні дрібні (1-1½мм) круглі блискучі напівпрозорі опуклі (S-
збудника шигельозу.					колонії). S.sonnei утворюють й R-колонії - плискуваті тусклі з шерехатою
					поверхнею та нерівними краями.
Особливості			ферментації		З утворенням кислоти без газу. Біовари S.flexneri: S.manchester, S.newcastle
шигелами глюкози.					– ферментують до кислоти та газу.
Особливості			ферментації		Не ферментують (за виключенням S.sonnei). S.sonnei ферментує повільно
шигелами лактози.					(через 48-72 години).
Біохімічні			особливості		Має найменшу ферментативну активність. Найважливіша особливість
S.dysenteriae.					– негативна реакція у тесті з манітом. Ферментує глюкозу з утворенням
					кислоти. Не ферментує лактозу, сахарозу, дульцит; реакція на індол
					негативна, не має ферменту каталази.
Біохімічні			особливості		Є більш активним видом: ферментує маніт, глюкозу ферментує з
S.flexneri.					утворенням кислоти або кислоти та газу, не ферментує лактозу, сахарозу,
					не має ферменту каталази, не утворює індолу.
Біохімічні			особливості		Є найбільш активним видом: здатна, хоча й повільно, ферментувати
S.sonnei.					лактозу, сахарозу; постійно ферментує маніт, мальтозу; глюкозу - з
					утворенням кислоти; має фермент каталазу, не ферментує дульцит, реакція
					на індол негативна.
Особливості			біохімічних		Володіють слабкою біохімічною активністю у порівнянні з представниками
властивостей			шигел	у	родів Escherichia та Salmonella.
порівнянні		з	іншими
ентеробактеріями
Мета		застосування			Ретроспективне обґрунтування діагнозу "шигельоз" при атипових та
серологічного методу.					субклінічних формах захворювання.
Особливості	серологічного				Реакцію аглютинації необхідно ставити у динаміці, щоб виявити зростання
методу			діагностики		титру антитіл (на 2-3-й та 8-10 день хвороби). Діагностичне значення має
шигельозу.					чотирикратне і більше зростання титру антитіл. У дітей 1-го року життя
					серологічне дослідження малоінформативне.
Що таке шигельоз?					Гостре антропонозне захворювання з фекально-оральним механізмом
					передачі, яке спричиняється бактеріями роду Shigella і характеризується
					ураженням кишечнику (переважно його дистального відділу) та
					інтоксикацією.
Особливості шигельозу.					Найбільш важкий перебіг має шигельоз, спричинений S.dysenteriae, яка
					продукує екзотоксин, менш складний – шигельоз, спричинений S.sonnei.
Основний біотоп збудника					Сигмовидна и пряма кишки.
Біологічні			властивості		Здатність до адгезії, проникнення в клітини епітелію слизової оболонки
шигел, що обумовлюють їх					товстої кишки та внутрішньоклітинного розмноження в них та у
патогенність.					макрофагах, викликаючи їх загибель. Надійний захист шигел від дії
					кислоти шлункового соку завдяки зовнішньої мембрани бактерії. Захист
					збудника від фагоцитозу забезпечується поверхневим К-антигеном,
					антигенами 3,4 та ліпополісахаридом. Ліпід А ендотоксину шигел володіє
					імуносупресивною дією – пригнічує активність клітин імунної пам‘яті.
Групи			факторів		1. Фактори, що визначають взаємодію з епітеліоцитами (фактори адгезії та
патогенності шигел.					колонізації). 2. Фактори, що забезпечують інвазію, резистентність до
					гуморальних та клітинних механізмів захисту макроорганізму та здатність
					розмножуватися в клітинах макроорганізму. 3. Токсини та токсичні
					речовини, які обумовлюють розвиток патологічного процесу (основний
					фактор патогенності).
Фактори, що			визначають		Пілі,	ліпополісахариди,	ферменти:	муциназа,	плазмокоагулаза,

5

взаємодію		шигел		з	гіалуронідаза, фібринолізин.
епітеліоцитами.
Фактори інвазії шигел					Білки зовнішньої мембрани (інвазини), білки внутрішньоклітинного
					розповсюдження. Забезпечують проникнення шигел у ентероцити,
					розмноження в ентероцитах та макрофагах, викликають апоптоз
					макрофагів, лізис мембран клітин, забезпечуючи внутрішньоклітинне та
					міжклітинне розповсюдження шигел
Токсини шигел					Екзотоксини – токсин Шига та шигаподібні токсини, ентеротоксин (LT),
					ендотоксин (ліпополісахарид, який пов‘язаний з О-антигеном клітинної
					стінки).
Особливості Шига-токсину,					Має нейротоксичну властивість, ентеротоксичну та цитотоксичну
що синтезує S.dysenteriae 1					активність. Ентеротоксичність проявляється посиленням діарейного
(шигела Григор‘єва-Шиги).					синдрому внаслідок активації аденілатциклази, збільшення екскреції води
					та електролітів у порожнину кишок. Цитотоксичність – токсин порушує
					біосинтез білку, всмоктування Na+ та води, викликаючи загибель
					ентероцитів та збільшення рідини в осередку спалаху. Токсин уражує
					ендотелій підслизової оболонки кишки, спричиняючи кров‘янистий
					пронос, гломерули нирок, призводячи до гемолітичного уремічного
					синдрому з розвитком ниркової недостатності.
Особливості		ендотоксину			Має особливий тропізм до епітелію слизової оболонки товстої кишки.
шигел					Ліпід А має й імуносупресивну дію – пригнічує активність клітин імунної
					пам‘яті. Захищає шигели від низьких значень рН та жовчі. Посилює
					перистальтику кишечника.
Етапи	патогенезу		гострого		Адгезія, колонізація, занурення шигел у цитоплазму ентероцитів, їх
шигельозу.					внутрішньоклітинне розмноження, руйнація ентероцитів та відторгнення
					епітелію, вихід збудника у порожнину кишечнику, формування ГСТ.
Особливості патогенезу при					1. Пусковим механізмом у патогенезі є адгезія збудника до слизової
шигельозі					оболонки кишки.
					2. Взаємодіючи з незміненими функційно активними ентероцитами,
					шигели примушують їх захоплювати себе шляхом інвагінації клітинної
					мембрани та утворення фагосомоподібних вакуолей.
					3. Гемолізин, що міститься у мікрокапсулі шигел, викликає розбухання та
					відторгнення інфікованих мікроворсинок слизової оболонки, пасивно
					звільняючи її від збудника.
					4. У тонкій кишці ентероцити мають рецептори до ентеротоксину, який
					спричиняє водянисту діарею, хоча збудник має здатність й занурюватися в
					епітелій тонкої кишки. Колоноцити мають рецептори для адгезії та інвазії
					шигел.
					5. Адгезія шигел на ентероцитах тонкої кишки пригнічується за рахунок
					руйнації панкреатичними ферментами їх поверхневих цитотоксичних
					білків. У товстій кишці цитотоксин шигел регенерує.
					6. Переважне ураження дистальних відділів товстої кишки обумовлено
					тривалим перебуванням в ній кишкового вмісту, токсинів та бактерій,
					створюючи сприятливі умови для масивної інвазії збудника у колоноцити.
Умови	переходу		гострого		Дисбактеріоз, порушення обміну речовин в організмі, гіповітаміноз.
шигельозу у хронічний					Слабка імуногенність збудника. Розвиток часткової толерантності до
					збудника. Набута недостатня активність імунних клітин. ГСТ.
					Внутрішньоклітинний паразитизм.
Особливості		імунітету		при	Напружений типоспецифічний (обумовлений антимікробними антитілами,
шигельозі					антитоксинами, підвищенням активності макрофагів та Т-лімфоцитів),
					перехресного імунітету не виникає.
					Місцевий імунітет слизової оболонки кишечнику, опосередкований IgAs.
Механізм			місцевого		Перешкоджають адгезії шигел на епітеліальних клітинах, проникненню їх у
імунітету					клітини, беруть участь у запобіганні імунологічного ушкодження
					кишечнику.
					АЛГОРИТМ ДІЇ

ПРИ ПРОВЕДЕННІ МІКРОБІОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ШИГЕЛЬОЗУ

6

Бактеріологічний метод Підготовчий етап ─ взяття матеріалу та підготовка його до бактеріологічного дослідження.

Для отримання позитивного результату бактеріологічного дослідження при заборі та посіві матеріалу необхідно дотримуватись певних правил:

1/ бактеріологічне дослідження матеріалу починати, по можливості, до застосування етіотропного лікування; 2/ посуд для взяття матеріалу ошпарити окропом і ні в якому разі не обробляти дезинфікуючими

розчинами, до яких шигели дуже чутливі; 3/ досліджуваний матеріал необхідно терміново (навіть біля ліжка хворого) посіяти одночасно у

збагачувальне середовище та на диференціально-діагностичне середовище; 4/ секційний матеріал дослідити якомога швидше після смерті хворого.

Основним матеріалом для бактеріологічного дослідження при маніфестній та субклінічній формах шигельозу є фекалії. Також дослідженню підлягають блювотні маси, промивні води шлунку та кишок, харчові продукти (особливо молоко, сир, сметана) при спалахах шигельозу та секційний матеріал (товста кишка, мезентеральні лімфатичні вузли, шматочки паренхіматозних органів). При підозрі на бактеріємію досліджуються кров та сеча.

Фекалії (1-2г) взяти скляною паличкою із судна або пелюшок, відбираючи грудочки слизу та гною (але не кров). Випорожнення можна брати з прямої кишки за допомогою стерильної петлі, не чекаючи акту дефекації. Якщо у випорожненнях хворого присутні слизово-гнійні грудочки – їх необхідно першочергово відібрати для бактеріологічного дослідження, промити у фізрозчині та посіяти на живильне середовище. У збагачувальне середовище грудочки слизу та гною посіяти без промивання. При відсутності слизовогнійних грудочок фекалії проемульгувати у фізрозчині (1:10). У збагачувальне середовище посіяти непроемульговані випорожнення у співвідношенні 1:5. При посіві блювотних мас та промивних вод використовувати збагачувальне середовище подвійної концентрації і співвідношення посівного матеріалу до середовища повинно складати 1:1.

І етап – посів матеріалу.

Матеріал (фекалії, ректальні мазки, блювотні маси, промивні води, харчові продукти, секційний матеріал, сечу) при захворюванні на шигельоз посіяти одночасно на диференціально-діагностичні середовища Левіна2, Плоскірева3 для отримання ізольованих колоній та у селенітовий бульйон з метою накопичення шигел, якщо їх недостатньо у досліджуваному матеріалі. Посіви інкубувати у термостаті при t=37°С протягом 18-24 годин.

ІІ етап – виділення чистої культури.

Вивчити культуральні властивості мікроорганізмів, що виросли на середовищах Левіна та Плоскирєва: шигели утворюють безбарвні дрібні (1-1½мм) круглі блискучі напівпрозорі опуклі колонії. При достатній кількості типових колоній поставити орієнтовну реакцію аглютинацію на склі з полівалентною аглютинуючою сироваткою для ідентифікації шигел. Частину аглютинабельної колонії посіяти на середовище Олькеницького для вивчення певних властивостей та виділення чистої культури. Якщо на середовищах Плоскірева та Левіна росту мікроорганізмів немає, або відсутні колонії, характерні для шигел, зробити висів матеріалу з селенітового бульйону на агари Плоскирєва та Левіна. Всі посіви поставити в термостат на добову інкубацію.

ІІІ етап – ідентифікація виділеної культури:

1/ за біохімічними властивостями: зробити облік росту шигел на середовищах Олькеницького, Гісса та на пептонній воді.

На середовищі Олькеницького шигели викликають ферментацію глюкози, змінюючи колір стовпчикової частини середовища частіше без газоутворення, лактозу шигели переважно не ферментують (колір скошеної частини не змінюється), сірководень ─ не утворюють (почорніння середовища не спостерігається).

Результатом вивчення біохімічних властивостей шигел на середовищах Гісса та у пептонній воді є визначення виду збудника (табл.1).

Таблиця 1

2 Середовише Левіна ─ важливе середовище при ідентифікації шигел, тому що вегетативні властивості середовища Плоскирєва недостатні для росту S.dysenteriae 1.

3 Агар Плоскирєва – селективне середовище для культивування шигел та сальмонел. Компоненти середовища інгубують ріст грампозитивної флори, значно затримують ріст ешерихій та роїння протею.

7

Біохімічні властивості бактерій роду Shigella

Ферментація

Утворення

Види шигел

лактози

глюкози

мальтози

маніту

дульциту

сахарози

ірководню

індолу

каталази

c

S.dysenteriae

─

к

─

─

─,+

─

─

─,+

─

S.flexneri

─

к/кг

±

+

±

─

─

─

─

S.boydii

─

к

±

+

±

─

─

─,+

─

S.sonnei

[+]

к

+

+

─

[+]

─

─

+

Умовні позначки: "+" - позитивна реакція, "─" негативна реакція, [+] - пізня реакція, що наступає не раніше 2-3 доби, "к" - ферментація до кислоти, "кг" – ферментація до кислоти та газу, "±" – більше число штамів дає позитивну реакцію, менше – негативну, "─,+" - більше число штамів дає негативну реакцію, менше – позитивну.

Найважливішою особливістю S.dysenteriae у порівнянні з іншими видами шигел є її негативна реакція у тесті з манітом. S.dysenteriae ферментує лише глюкозу з утворенням кислоти. Загалом характерним для S.dysenteriae є її слабка ферментативна активність.

Більш біохімічно активною є S.flexneri - ферментує маніт, глюкозу ферментує з утворенням кислоти або кислоти та газу, але не ферментує лактозу, сахарозу, не має ферменту каталази та не утворює індолу.

Найбільш активною за ферментативними властивостями є S.sonnei. Вона здатна, хоча й повільно, ферментувати лактозу, сахарозу, постійно ферментує маніт, мальтозу, глюкозу з утворенням кислоти, володіє ферментом каталазою, але не ферментує дульцит і дає негативну реакцію на індол.

2/ за антигенними властивостями: серологічну ідентифікацію виділеної чистої культури провести за допомогою реакцій аглютинації на склі спочатку з полівалентною аглютинуючою сироваткою проти шигел Флекснера та Зонне, які найчастіше викликають шигельоз, а потім з видовими, типовими та груповими аглютинуючими сироватками для визначення серовару чи підсеровару шигели.

Окрім діагностики шигельозу, бактеріологічне дослідження необхідно проводити також для виявлення осіб з атиповою, легкою або субклінічною формами інфекції серед працівників продовольчих підприємств, дитячих установ і лікарняних закладів та обстеження контактних осіб. З метою встановлення джерела інфекції при спалахах інфекції необхідно визначити фаговар шигели.

Експрес-метод діагностики шигельзу.

З метою швидкої та надійної ідентифікації виду чи серовару шигел поставити пряму або непряму реакцію імунофлуоресценції з люмінесцентними шигельозними сироватками. При наявності в досліджуваному матеріалі збудника шигельозу він утворює комплекс з сироваткою, яка має люмінесцентну мітку, та утворений комплекс викликає світіння у люмінесцентному мікроскопі.

Серологічний метод діагностики.

Застосовується для ретроспективного обґрунтування діагнозу шигельозу при атипових (стертих) та субклінічних формах захворювання. Інфекційний процес не супроводжується значним антигенним подразненням, тому титри антитіл у сироватках хворих та реконвалесцентів невисокі. Їх виявляють на 5-8 добу захворювання. Найбільша кількість антитіл утворюється на 2-3 тижнях.

Для серодіагносики шигельозу можна поставити розгорнуту реакцію аглютинації з шигельозними діагностикумами по типу реакції Відаля. Сироватку крові протитрувати від 1:50 до 1:800. Діагностичним титром антитіл до S.flexneri у дорослих хворих є 1:200, до S.dysenteriae та S.sonnei – 1:100 (у дітей відповідно 1:100 та 1:50).

Більш достовірні результати щодо захворювання на шигельоз отримують при постановці РНГА з парними сироватками. Діагностичне значення має зростання титру антитіл у 4 і більше разів.

8