4. Охарактеризуйте свойства днк-лигазы и определите ее роль в генной инженерии.

Лигаза (лат. ligāre — сшивать, соединять) — фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лигирование). При этом обычно происходит отщепление (гидролиз) небольшой химической группы от одной из молекул.

Лигазы относятся к классу ферментов EC 6.

В молекулярной биологии лигазы подкласса 6.5 классифицируют на РНК-лигазы и ДНК-лигазы.

У млекопитающих классифицируют три основных типа ДНК-лигаз.

• ДНК-лигаза I лигирует фрагменты Оказакив ходерепликацииотстающей цепи ДНК и участвует в эксцизионной репарации^[3].

• ДНК-лигаза III в комплексе с белком XRCC1участвует вэксцизионной репарациии в рекомбинации.

• ДНК-лигаза IV в комплексе с XRCC4катализирует окончательный этап негомологичного соединения (non-homologous end joining - NHEJ) двунитевых разрывов ДНК. Также требуется для V(D)J рекомбинации геновиммуноглобулинов.

Ранее выделяли ещё один тип лигаз - ДНК-лигазу II, которая позднее была признана артефактом выделения белков, а именно продуктом протеолиза ДНК-лигазы III^[4].

На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50-60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали кишечная палочка (E. Coli), ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

5. На каком принципе основана селекция бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы днк? Приведите один из примеров такой селекции.

ри молекулярно-генетических исследованиях было установлено, что в клетках бактерий имеются ферменты-рестриктазы, способные «разрезать» на фрагменты молекулы ДНК в строго определенных участках. Имеются также ферменты-лигазы, воссоединяющие фрагменты ДНК.

В клетках некоторых бактерий, помимо основной большой хромосомы, имеется еще маленькая кольцевая молекула ДНК — плазмида, В генной инженерии плазмиды, используемые для введения необходимой информации в клетку-хозяина, называют векторами. Кроме плазмид, роль векторов могут выполнять и бактериофаги. Чаще всего в качестве бактерии-хозяина используется наиболее изученная бактерия – кишечная палочка ( Escherihia coli ), но могут быть использованы и другие бактерии, а также дрожжи.

Можно выделить следующие основные этапы создания генетически измененных организмов: получение гена, кодирующего интересующий признак; объединение его с плазмидой-вектором; введение вектора с интересующим геном в клетку-хозяина; отбор клеток, получивших дополнительный генетический признак, и практическое их использование.