2 Метод – белок-ат (вестерблот гибридизаци).

Сейчас существует метод, который позволяет работать более простыми методами.

Метод fish – флюоресцентная in situ гибридизация.

Самая большая проблема получиь пластинки, в них находтся диски эухроматина и гетерохроматина. Тонкое исследование остаточно проблематично. Изотопный анализ в системе ч-б. получали метофазную пластинку на стекле ее денатурир и смеш с зондом смеш флюрисц меткой, зонд гибридизировался с комплиментарным участком. Метод мгновенно просочился в клиник. В интерфазном ядре хром сохран и могут гибридизов, то можно не выделть интерфазные пластинки. Можно использовать на интерфазном ядре.

Фиш модно использовать для выявление дупликации. Можно детектировать делеции. Наиболее частоиспользуемых зондов – зонд к гену р53 –активно используется для диагностики онкологических заболеваний. Если нет делеции – то заболев можно вылечить препаратами.

Можно выявлять транслокации. Берем 2 зонда и ели у нас 4 отдельных пятна своего цвета, то никаких нарушений генома в данном фрагм не произошло. Если 2 нормальных пятна, а оставшиеся 2 другие, они сливаются- следоватьельно зонды слились – есть транслокация. Зонд на транслокацию – самый активноиспользуемый. Этот зонд ипользовался для гематологического заболевания – онкология крови.

Хронический миелолейкоз – при лейкозах бластые клетки недотрансформированы. В хронич лейкозе кл не доконца дифференцированы и медленно делятся. Срок жизни 4-5 лет. При образовании филадельфийской хромосомы- железный милолейкоз. Филадейфийская хромосома образ из трансолокации 9 и 22 хромосомы. Образ химер транскриптон химерной транскриптон тирозиновой киназы.

Был создан зодн к промотору и тирозин киназе. Если зонды располож на разных участках – здоров. Если слияние, диагноз поставлен.

ПЦР.

1 статья в 1986г. Было известно, что существуют спец затравки – они отожгутся на комплиментарные цепи ДНК. С ориджин связыва только ДНК-полимераза 3, 1-ая ДНк полимераза. ДНКполим 1 не содержа нуклазной активностью – фрагмент кленова – использ для зашивки брешей в ДНК, для синтеза, меченья фрагментов. Синтезируют на встречу – д2 фрагмента кленова. Далее денатурируем. И каждый следующий цикла. Циклическое повторение – денатурация 94С, затравка-матрица, достройка.

Пробема- оптимум температуры 37С у фрагмента кленова, после каждого этапа денатурации и отжига необходимо докапывать ДНК полимеразу. Основная пресс=лесть – использование таг – полимеразы из термус акватику – бактерия обитающая при 94С. Оптимум еевункционирвания 72 градуса, этот фермент в состоянии пережить темпер 94 градуса.

Условия ПЦР.

1. Матрица

2. Буфер, соли

3. Магний

4. Неионный детергент тритон 100

5. Смесь дезоксинуклеотидов

6. Затравки – праймеры – синтезируют в специальных фирмах. Концентрация праймеров 10пико моль на концентрацию, до 5 микомоль, редко 15-20 пикомоль. Можно синтезировать праймеры с помощью ПЦР (20-25 н).если меньше температура отжига ниже и отжигается со сходными (гомологичными) – специф ПЦР резко падает. Хотя в реакциях требуется получение набора полос –исп меньшие температуры. Меньше вероятность образования 2-ой цепью с соседним участком.

7. Taq – полимераза 1,25-2,5 единиц ( до 10 единиц на реакцию)

На специфичность влияет правильный подбор праймеров. Необходимо проверить ГС состав. На 3 конце должна быть СС, ГГ. в праймере больше ГС – выше темпер отжига- выше специфичность и никаких блоков из 3-4 одинаковых букв- снижают специфичность.

Концентрация Mg влияет на специфичность – реакция иначе не пойдет, если его нет. Повышая концентрацию-повышаем специфичность.

Стандартный предел концентрации Mg от 1,5-3,5.

3 – температура отжига- это цикл ПЦР. 1 цикл – 1-5 мин на 94С. 2 цикл – амплификация м.б. одноэтапная, 2-х этапная.

1-этапная – наблюдается от 20-40 циклов. 30-35 самые частые циклы. Каждый цикл состоит из 3-х этапов. 1-денатурация от 30 сек-1 мин. Отжиг. Темпер зависит от темпер отжига праймеров. Разница в 1-2 градуса несмерт. От 30-1мин.3 –дотройка 70С –отптимум полимеразы. Зависит от длины амплифиц фрагмента за 50 сек – синтез 1 килобаза (1 тпн).

Иногда, когда высокая температруа отжига используется 2-х тактнй ПЦР, отжиг и достройка при одной температуре, объединяют. Для ГС богаых праймеров.

Двух этапный ПЦР на 1 этапе – накопительные циклы – характерно длямалого количества матри ДНК.5-10 циклов идет наработка с низкой специфичностью.

Достройка – необязат 70С, 5-10мин.

ПЦР используется для амплификации фрагментов. Просочился в клиническую практику.

ПЦР-ПДРФ

АК замена- это результат нуклеотидной замены. У ДНК есть сайты рестрикции. Если 1 нуклеотид и не входит в его состав сайта рестрикции и появляются сайты рестрикции. У одного не разрезается. У гомозиготного режутся все 3 фрагмента. Выявляют группу риска – рак легких. Сайт рестрикции может не возникнуть, а может исчезнуть. При мутации не режется.