ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ  «ИНСТИТУТ ПОДГОТОВКИ НАУЧНЫХ КАДРОВ  НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ» Кафедра естественно-научных дисциплин С. Е. Дромашко ГЕНЕТИКА И ВИРУСОЛОГИЯ В СОВРЕМЕННОЙ МЕДИЦИНЕ Учебно-методическое пособие  Минск  2008 УДК [575:61+578.7+577.21](075.8) ББК 28.704я73 Д75 Рекомендовано к опубликованию Ученым советом  Института подготовки научных кадров НАН Беларуси протокол № 5 от 26.05.2008 г. Рецензенты: главный научный сотрудник ГНУ «Институт генетики и цитологии  НАН Беларуси»,  доктор биологических наук Т. Д. Кужир, проректор по научной работе УО «Международный государственный  экологический университет имени А. Д. Сахарова»,  доктор биологических наук, профессор С. Б. Мельнов Дромашко, С. Е. Д75 Генетика и вирусология в современной медицине : учеб.-метод. пособие / С. Е. Дромашко. – Минск : Ин-т подгот. науч. кадров Нац. акад. наук Беларуси, 2008. – 53 с. : ил. ISBN 978-985-6820-19-2. В пособии дано подробное описание молекулярной природы наследственных заболеваний и современных подходов к их предотвращению и лечению, рассматриваются теоретические и практические аспекты явления РНК-интерференции, обсуждаются проблемы новых и возникающих вирусных инфекций. Для закрепления знаний служат вопросы для проверки усвоения материала и задания для самоподготовки. Пособие ориентировано на магистрантов, аспирантов, соискателей и студентов, изучающих современные проблемы генетики, физиологии и медицинской биологии. УДК 575:61+578.7+577.21 ББК 28.704я73 ISBN 978-985-6820-19-2 © Дромашко С.Е., 2008 © ГУО «Институт подготовки научных кадров Национальной академии наук Беларуси, 2008

Оглавление
1	Введение………………..……………………………………………….	5
2	Молекулярная природа наследственных заболеваний и современные подходы к их лечению..…..……………………………………….	5
2.1	Классификация моногенных и мультифакторных заболеваний человека и их молекулярная основа………………………………….....	5
2.2	Митохондриальные заболевания человека..………………………….	12
2.3	Принципы молекулярной диагностики наследственных и ненаследственных заболеваний человека на разных этапах онтогенеза…..….	13
2.4	Генная и клеточная терапия моногенных и мультифакторных заболеваний…..………………………………………………………………	16
2.5	Молекулярная геномика……………..…………………………………	19
2.6	Понятие о генетическом паспорте человека……………..……………	20
	Вопросы для проверки усвоения материала…………..………………	21
3	РНК-интерференция: теоретические и практические аспекты……....	22
3.1	Малые РНК как индукторы РНК-интерференции……..……………	22
3.2	Структурно-функциональная организация и биогенез микро-РНК, коротких интерферирующих РНК и других малых РНК……………	23
3.3	Функциональная роль РНК-интерференции…..…………………….	26
3.4	Использование явления РНК-интерференции и малых РНК в функциональной геномике и экспериментальной генотерапии…..………	28
	Вопросы для проверки усвоения материала….…………………..…...	32
4	Проблемы новых и возникающих вирусных инфекций……………...	32
4.1	Новые вирусы: ВИЧ, гепатита С, гепатита GB, герпесвирусы 6, 7, 8, атипичной пневмонии, их характеристика и вызываемы ими заболевания…………………………………………………………………..	32
4.2	«Возникающие» вирусные инфекции (вирусы Эбола, Денге, Хантаан и др.), их свойства и распространение……………………………..	41
4.3	Возможные причины появления новых и возникающих вирусных инфекций...….	49
	Вопросы для проверки усвоения материала……………..…………....	50
	Задания для самоподготовки……………..…………………………….	51
	Литература………………………………………………………………	52

1 Введение

Курс «Современные проблемы биологии» призван обеспечить специальную подготовку студентов магистратуры в области биологии на второй ступени высшего профессионального образования.

Основные задачи: расширить профессиональный кругозор будущих специалистов высшей квалификации в предметной области биологических наук; ознакомить студентов магистратуры с наиболее актуальными направлениями современных биологических исследований и их прикладными аспектами; углубить специальные знания магистрантов по наиболее актуальным вопросам современной биологии. В пособии приведены основные материалы лекций о медицинских аспектах современной биологии, которые помогут магистрантам освоить раздел «Генетика, физиология и медицинская биология». Большая часть иллюстраций взята с сайтов, приведенных в списке рекомендованных интернет-ресурсов. 2 МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПРИРОДА НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ИХ ЛЕЧЕНИЮ

2.1 Классификация моногенных и мультифакторных заболеваний человека и их молекулярная основа

Здоровье, или предрасположенность к различным заболеваниям, в значительной мере зависит от генетических особенностей человека. В бывшем Советском Союзе развитие медицинской генетики связывалось с именем академика Н.П.Бочкова, создателя Института медицинской генетики АМН СССР (ныне Медико-генетический научный центр РАМН). Успешное завершение международного проекта «Геном человека», расшифровка структуры генома человека и целого ряда других организмов открыли недоступные ранее возможности для понимания молекулярных основ наследственных болезней, разработки новых стратегий диагностики и лечения.

На рисунке 1 показано огромное количество генов, участвующих в развитии и функционировании органов и тканей человека. Неполадки в каждом из них могут привести к тяжелым, иногда смертельным наследственным заболеваниям(hereditary diseases). В настоящее время известно пять тысяч наследственных заболеваний, из них две тысячи представляют собой тяжелые расстройства, приводящие к инвалидности. Подробности о многих заболеваниях и их молекулярно-генетических особенностях можно найти в разделе «Генетика» Базы знаний по биологии человека HUMBIO, которая создана и поддерживается Институтом молекулярной генетики РАН.

До недавнего времени были изучены главным образоммоногенные болезни, т.е. возникающие при нарушении работы одного гена. Сегодня их известно более тысячи – от них страдает в общей сложности около 5% новорожденных. Однако большинство наследственных болезней связаны с одновременным нарушением работы нескольких генов и определенными воздействиями внешней среды – их называют мультифакторными болезнями. В той или иной мере наследственные особенности определяют восприимчивость организма или его устойчивость относительно большинства заболеваний, в том числе инфекционных. Поэтому здоровье или болезнь – фактически результат взаимодействия наследственных задатков и среды.

Геномные исследования позволяют выявлять предрасположенность к ряду патологий на любой стадии развития организма, что расширяет объем пресимптоматической, дородовой ипреимплантационной (предшествующей внедрению зародыша в матку) диагностики. Для этого проводится анализ ДНК, получаемой обычно из крови или других биологических образцов индивида.

Рисунок 1 – Количество генов, вовлеченных в развитие и функционирование органов и тканей человека.

Наследственные заболевания обусловлены хромосомными перестройками и генными мутациями. У человека различают наследственные заболевания с полным проявлением мутации (все хромосомные и некоторые генные) – синдром Дауна, гемофилия А, В, С, фенилкетонурия и др.; с неполным (зависящим от условий среды) проявлением мутаций – некоторые формы диабета, подагра и др.; возникающие из-за внешних факторов, но обусловленные генетической предрасположенностью к ним – аллергия, атеросклероз, рахит и др. Среди генных наследственных заболеваний выделяют моногенные и полигенные (мультифакторные), а среди моногенных различают формы с разным типом наследования (аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные, доминантные сцепленные с полом и рецессивные сцепленные с полом). Доля наследственных составляет около 10% всех заболеваний человека.

Хромосомные болезни – это группа болезней, в основе развития которых лежат нарушения числа или структуры хромосом, возникающие в гаметах родителей или на ранних стадиях дробления зиготы. История изучения хромосомных болезней берет начало с клинических исследований, проводившихся задолго до описания хромосом человека и открытия хромосомных аномалий. В частности, к ним относятся болезнь Дауна (трисомия 21), синдромы Тернера (трисомия 18), Клайнфелтера, Патау (трисомия 13), Эдвардса. В настоящее время описано два варианта нарушений числа хромосомных наборов – тетраплоидия и триплодия. Другая группа синдромов обусловлена нарушениями числа отдельных хромосом – трисомиями (когда имеется добавочная хромосома в диплоидном наборе) или моносомиями (одна из хромосом отсутствует). Моносомии аутосом несовместимы с жизнью. Трисомии – более часто встречающаяся у человека патология. Ряд хромосомных болезней связан с нарушением числа половых хромосом. Самая многочисленная группа хромосомных болезней – это синдромы, обусловленные структурными перестройками хромосом. Выделяют хромосомные синдромы так называемых частичных моносомий (увеличение или уменьшение числа отдельных хромосом не на целую хромосому, а на ее часть).

Моногенные заболевания. Рассмотрим некоторые наиболее часто встречающиеся моногенные болезни, т.е. болезни, возникающие в результате нарушения работы одного гена. Прифенилкетонурии мутации нарушают работу гена, контролирующего превращение аминокислоты фенилаланина в тирозин. Болезнь развивается, когда ребенок получает поврежденный ген от обоих родителей. Если один из пары генов нормален, человек остается здоровым. Сегодня частота появления фенилкетонурии (т.е. мутаций в обеих копиях гена) составляет 1 на 10–17 тыс. рождений, а частота скрытого носительства болезнетворного аллеля – 1 на 100. Поскольку эта патология встречается достаточно часто, всех новорожденных тестируют на фенилкетонурию. Вовремя назначенная специальная диета может предотвратить болезнь или облегчить ее течение. У каждого народа свой спектр характерных мутаций. Например, в Волго-Уральском регионе России фенилкетонурия особенно часто встречается среди русских. Большинство случаев заболевания вызвано одной и той же мутацией, привнесенной сюда переселенцами из Северной Европы. В семьях других национальностей фенилкетонурия вызывается несколькими различными мутациями.

При аутосомно-рецессивном заболевании – болезни Вильсон–-Коновалова – из-за мутаций в гене, связанном с обменом меди, в организме накапливается медь. В результате ее токсического воздействия поражаются печень и головной мозг. Заболевание долгое время протекает скрытно, ранние проявления весьма многообразны, что затрудняет его выявление. Болезнью Вильсона–Коновалова страдают во всем мире, причем некоторые народы особенно часто. Так, у евреев ашкенази ее частота в 30 раз превышает среднемировую. В настоящее время известно более 70 различных мутаций, приводящих к этой патологии. В некоторых этнических группах, наряду с широко известными, можно обнаружить “молодые” мутации, свойственные только им. Например, у представителей татарской национальности выявлена мутация, которая нигде больше не встречается. Молекулярно-генетический анализ позволил предположить ее тюркские корни.

Этнические особенности обнаружены в спектре и частоте мутаций для такой тяжелой патологии, как муковисцидоз. У представителей белой расы – это одно из самых распространенных моногенных заболеваний. Изменения в гене белка, участвующего в переносе ионов хлора через клеточную мембрану, приводят к нарушению секреции эндокринных желез с поражением дыхательного и желудочно-кишечного трактов. В Башкортостане выявлено девять связанных с муковисцидозом мутаций, а всего в мире их описано более тысячи. В Волжско-Уральском регионе “европейская” мутация найдена у русских и татар, а “тюркская” – у татар и башкир.

Большинство моногенных мутаций проявляется на самых ранних этапах развития – в детстве или даже во внутриутробном периоде. При болезнях плода чаще всего нарушается работа белков, регулирующих одновременно множество генов (факторов транскрипции). На первом году жизни наиболее часты нарушения, связанные с обменом веществ. Однако некоторые генетические дефекты могут не проявляться до глубокой старости. Например, в генах белков пресениллинов (PS) найдены мутации, приводящие к болезни Альцгеймера – одной из форм старческого слабоумия. А встраивание избыточных тринуклеотидных повторов в “гентингтон”-ген связано с другой болезнью, также проявляющейся в преклонном возрасте, – хореей Гентингтона.

Мультифакторные заболевания. К мультифакторным, или полигенным заболеваниям относятся болезни, развитие которых зависит от взаимодействия множества факторов – наследственных и средовых (рисунок 2). В этой группе заболеваний можно указать такие болезни, вызванные порками развития, каксахарный диабет, ишемическая болезнь сердца, эссенциальная гипертензия, язвенная болезнь, бронхиальная астма. Сейчас к мультифакторным наследственным заболеваниям относят даже алкогольный психоз и наркоманию. Уже известны некоторые гены, обусловливающие предрасположенность к таким заболеваниям. Патогенные мутации в этих генах не обязательно приводят к заболеванию, но риск его развития повышенный. При этом соотношение влияния наследственных ("гены риска") и внешних факторов у больных неодинаково. Например, хотя для ишемической болезни сердца характерна сложная этиология, примерно 5% больных с ранним инфарктом миокарда гетерозиготны по мутации гена, вызывающей семейную гиперхолестеринемию – моногенную болезнь, проявляющуюся в развитии атеросклероза даже при отсутствии неблагоприятных внешних факторов. Однако на проявления семейной гиперхолестеринемии влияют другие гены, например ген апопротеина В, ген апопротеина (а), ген липопротеидлипазы и ген апопротеина Е, а также внешние факторы: режим питания или курение. Риск заболевания зависит от множества наследственных и внешних факторов. 

Рисунок 2 – Факторы развития мультифакторных заболеваний

Как видим, предрасположенность к мультифакторным болезням возникает тогда, когда нарушена регуляция различных систем – нейроэндокриных, иммунных, обмена веществ, – в том числе обезвреживания чужеродных веществ (так называемых систем трансформации-детоксикации ксенобиотиков). Отметим, что в организме ксенобиотики разлагаются в два этапа: сначала подвергаются ферментативной модификации, а лишь затем промежуточные метаболиты превращаются в растворимые безвредные соединения и выводятся. При этом промежуточные метаболиты могут отличаться более высокой мутагенной и онкогенной активностью, чем сами ксенобиотики или конечные продукты их разложения.

Различные варианты генов, кодирующих ферменты системы детоксикации, определяют скорость их работы. В частности, при сниженной активности детоксификационной функции плаценты (фермента плацентарной глютатион-метионинтрансферазы, GSTM1) возрастает риск ранних спонтанных абортов. Генетически детерминированная активность глютатионтрансфераз влияет и на развитие различных форм рака. Например, сочетание определенных мутаций увеличивает риск рака груди у женщин в 3–10 раз, а у курильщиц – в 40 раз.

В лаборатории моделирования генетических процессов Института генетики и цитологии НАН Беларуси кандидаты биологических наук Э.В.Крупнова и Н.Н.Чакова в рамках заданий ГКПНИ «Биологическая инженерия и биобезопасность» и ГП «Биотехнология» ведут паспортизацию по молекулярному маркеру GST в целях диагностики наследственной предрасположенности к заболеваниям органов дыхания.

Заболеваемость органов дыхания различного происхождения у взрослого и детского населения неуклонно возрастает во всем мире. Данная патология является лидирующей:

• по количеству дней нетрудоспособности;

• инвалидности;

• смертности (четвертое, пятое места)

Анализ полиморфизма GST-генов осуществлялся с использованием метода мультиплексной ПЦР. Гомозиготность по «нулевым аллелям» генов GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию на электрофореграммах фрагментов амплификации размером 480 и 215 п.н. соответственно.

Таким образом, при изучении полиморфизма GST-генов у больных так называемымнемелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) в белорусской популяции выявлено:

• частота встречаемости нулевых генотипов GSTM1(-) и GSTT1(-) составляет 36,7 и 26,7% соответственно;

• генотип GSTT1(-) в группе некурящих больных встречался со статистической достоверностью в 1,5 раза чаще (36,4%), чем у курящих пациентов (23,7%).

Совместно с генетиками Республиканского научно-практического центра «Мать и дитя» начато изучение полиморфизма GST-генов у детей Беларуси с целью разработки технологии выявления наследственной предрасположенности к заболеваниям органов дыхания различной этиологии. Планируется провести анализ делеционного полиморфизма в генах системы детоксикации у новорожденных, у детей, страдающих бронхиальной астмой, у детей с хроническим обструктивным бронхитом, а также у здоровых детей того же возраста и определить частоту встречаемости нулевого генотипа в этих когортах.

Эффективность лечения различными препаратами также связана с состоянием генов. Например, лечение эндометриоза (заболевания, встречающегося почти у 10% женщин белой расы) широко используемым препаратом циклофероном у части больных безрезультатно по причинам генетического характера. Наши исследования также позволят прогнозировать чувствительность пациентов к лекарственным препаратам различных фармакологических групп, в метаболизме которых участвуют глутатион-S-трансферазы, что поможет индивидуализировать медикаментозную терапию и снизить риск побочных эффектов.

К настоящему времени на хромосомах человека картировано около 800 генов, мутации которых приводят к различным наследственным заболеваниям. Количество моногенных заболеваний, для которых известна локализация контролирующего гена, еще больше и приближается к 950 за счет существования аллельных серий, т.е. групп болезней, клинически сильно отличающихся, но обусловленных мутациями в одном и том же гене. Среди них гены, обусловливающие предрасположенность к остеопорозу (VDR-3), дефектам заращения нервной трубки (ДЗНТ), коронарной болезни сердца (КБС) и атеросклерозу (MTHFR), инфаркту миокарда (АСЕ), атеросклерозу (АроЕ), аденоме и раку простаты (AR), диабету (IDDM-1 и -5), астме (СС16) и др. Известны также онкогены (Ras, Miс) и антионкогены (p53), мутации которых с большой вероятностью ведут к различным опухолям. Уже идентифицированы гены, мутации которых не только предрасполагают, но и с большой вероятностью вызывают серьезные заболевания (BRCA1, BRCA2 – рак молочной железы, PS-1, PS-2 – болезнь Альцгеймера и др.). Быстро увеличивается и список наследственных болезней с поздней манифестацией, для которых вполне реальна ранняя досимптоматическая диагностика в любом возрасте (хорея Гентингтона, другие нейродегенеративные заболевания, рак толстой кишки, щитовидной железы и др.).

Наконец, уже сегодня можно выявлять гетерозиготное носительство наиболее частых смертельных наследственных болезней в семьях высокого риска (муковисцидоз, миодистрофия Дюшена, фенилкетонурия, синдром Мартина–Белла, гемофилия, спинальная мышечная атрофия, адреногенитальный синдром). Очень важно, что эти и многие другие тяжелые наследственные недуги с успехом диагностируются уже пренатально, что позволяет выявить возможность рождение больных детей.

2.2 Митохондриальные заболевания человека

В настоящее время известно более 100 точковых мутаций и несколько сот структурных перестроек митохондриальной ДНК (мтДНК), связанных с характерными нейромышечными и другими митохондриальными синдромами: от летальных в неонатальном периоде жизни – до заболеваний с поздним началом. Непосредственная причина возникновения и развития митохондриальных расстройств кроется в дефектах системы окислительного фосфорилирования. Благодаря выявлению все большего количества пациентов и описанию сотен родословных, сведения о взаимоотношении между генотипом и фенотипом, структуре и частоте встречаемости патогенных и условно-патогенных мутаций мтДНК в популяциях накапливаются ускоренными темпами.

Можно привести следующую классификацию патогенных мутаций мтДНК:

• Смысловые мутации в структурных генах. Наиболее типичным заболеванием, ассоциированным со смысловыми заменами в митохондриальном геноме, является наследуемая по женской линии нейропатия (атрофия) зрительных нервов Лебера (LHON).

• Мутации мтДНК, приводящие к нарушениям синтеза белка. Прогрессирующая с возрастом нейросенсорная глухота, если она наследуется по линии матери, часто ассоциируется с заменой А на Г в позиции 1555 гена 12S рРНК.

• Структурные перестройки мтДНК. Описано множество перестроек в мтДНК (дупликации, делеции или их комбинации), приводящих к нарушениям в системе окислительного фосфорилирования. Такие перестройки обнаружены у больных нейромышечными заболеваниями типа синдрома Кернса–Сейра (KSS), при прогрессирующей наружной офтальмоплегии (СРЕО) и синдроме Пирсона (болезнь костного мозга и поджелудочной железы).

• Взаимодействие двух геномов. Хотя большинство генов, продукты которых ответственны за нормальное функционирование системы окислительного фосфорилирования, располагаются в хромосомах, сегодня известно всего несколько локусов, мутации в которых могут рассматриваться как причина митохондриальной болезни. В качестве примера можно сослаться на синдром нейрогастроинтестинальной энцефалопатии (MNGIE), обусловленной мутацией гена тимодинфосфорилазы. Кроме того, в основе возникновения некоторых митохондриальных миопатий, таких как офтальмоплегия и птоз, может находиться дестабилизация молекулы мтДНК, инициируемая мутациями в ядерных генах.

Рисунок 3 – Карта мтДНК человека с указанием положения генов и относительно часто встречающихся патогенных мутаций

В лаборатории нехромосомной наследственности Института генетики и цитологии НАН Беларуси под руководством члена-корреспондента О.Г.Давыденко и кандидата биологических наук Н.Г.Даниленко в содружестве с РНПЦ «Мать и дитя» ведется разработка методов ДНК-диагностики митохондриальных заболеваний человека, в частности вышеупомянутого синдрома Лебера. Изучается также генетическая предрасположенность белорусов к сердечно-сосудистым заболеваниям, ведется анализ генотипического риска в белорусской популяции по ключевым белкам липидного метаболизма и т.д. Успешно выполнен инновационный проект по геногеографии белорусов на основе анализа митохондриальной ДНК и Y-хромосомы.