5.3. Дестабилизация связей

Известно, что изменение геометрии связей может приводить к их дестаби-лизации. В качестве примера можно привести катализ гидрирования ме-таллическим палладием или гидролиз ациклического и циклического фос-фита: константа скорости гидролиза циклического этиленфосфита на семь порядков больше константы скорости гидролиза диметилфосфита:

и ,

что связано с разной геометрией связей в этих двух соединениях. К этой же группе возможных влияний относится и изменение характера сольвата-ции промежуточных продуктов или переходных состояний. Этот эффект иллюстрируется реакцией декарбоксилирования продукта присоединения пировиноградной кислоты к соли диметилтиазолия, имитирующей in vitro тиаминпирофосфат – кофермент пируватдекарбоксилазы.

В воде продукт присоединения пирувата достаточно устойчив, в спирте скорость декарбоксилирования возрастает на 4-5 порядков, а в полярном апротонном диметилсульфоксиде скорость декарбоксилирования не удает-ся измерить, так как уже при растворении в нем продукта присоединения происходит вспенивание от выделяющегося диоксида углерода.

5.4. Согласованный кислотно-основный катализ

В органической химии известно достаточно большое количество реакций, катализируемых кислотами и основаниями, но только ферменты могут в результате структурной перестройки молекулы последовательно менять окружение у промежуточного соединения, создавая в нанопространстве ак-тивного центра полярную и аполярную среду, кислую или щелочную сре-ду. В качестве примера можно привести катализируемую лиазой реакцию гидратации фумаровой кислоты

Фермент фумараза присоединяет молекулу воды по двойной связи фума-ровой кислоты с образованием L-яблочной кислоты. Это превращение протекает при температуре не превышающей 40С быстро и избирательно благодаря тому, что в активном центре фермента на разные атомы углеро-да, соединенные двойной связью, одновременно действуют кислота и основание. Понятно, что создать аналогичные условия в растворе невоз-можно. Для гидратации двойных связей синтетическим путем приходится, например, нагревать вещество с серной кислотой.

5.5. Ингибирование ферментов

Ингибирование ферментов представляется важным как с токсикологичес-кой, так и с фармакологической точки зрения. Особое место занимают процессы необратимого ингибирования ферментов. Чаще всего это свя-зано с нарушением нативной структуры апофермента. В частности, такими ингибиторами являются ионы тяжелых металлов, образующих прочные связи с сульфгидрильными группами, алкилаторы, например иодуксусная кислота, которая реагирует по имидазольным фрагментам белка (из гисти-дина) и по другим нуклеофильным центрам. Необратимыми ингибиторами металлопротеиновых ферментов (каталаза, супероксиддисмутаза) являют-ся сильные восстановители (арсин, фосфин), которые изменяют валент-ность ионов участвующих в катализе тяжелых металлов (марганец, ко-бальт, железо), переводя их даже в металлическое состояние, и некоторые кислоты (сероводород, синильная кислота), образующие прочные соли с этими металлами. Однако, возможны необратимые блокировки ферментов и в результате превращения простетических групп и коферментов. Так, например, некоторые гидразиды кислот переводят в гидразоны формиль-ные группы пиридоксальфосфатзависимых трансаминаз и декарбоксилаз и нарушают, в частности, биосинтез аминных нейромедиаторов, участвую-щих в передаче нервных импульсов.

С фармакологической точки зрения наиболее интересны обратимые инги-биторы ферментов. Причем, здесь можно выделить три вида ингибирова-ния – конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное. В случае конку-рентного ингибирования речь может идти о взаимодействии с активным центром фермента вещества, строение которого подобно строению естест-венного субстрата (метаболита), поэтому такие вещества часто называют антиметаболитами. В качестве примера можно привести реакцию дегид-рирования янтарной кислоты сукцинатдегидрогеназой, протекающую по схеме:

Эта реакция блокируется многими соединениями, сходными по строению с янтарной кислотой, но неспособными к реакции дегидрирования. Антиме-таболитами янтарной кислоты являются малоновая кислота, щавелевая кислота, глутаровая кислота, фенилпропионовая кислота. В частности, сродство малоновой кислоты к активному центру фермента даже выше чем у естественного субстрата: 50 %-ное ингибирование фермента происходит при концентрации малоната в 50 раз ниже концентрации сукцината. При конкурентном ингибировании пониженную ингибитором скорость ре-акции можно повысить до прежнего значения повышением концентрации субстрата.

Еще один пример – антиметаболит фолиевой кислоты метотрексат. Фолие-вая кислота переносит одноуглеродные фрагменты с образованием пяти-членного цикла (см. выше), а ее структурный аналог метотрексат с тре-тичной аминной группой не может реагировать по этой схеме

Фолиевая кислота синтезируется бактериями с участием п-аминобензой-ной кислоты (обязательный фактор роста многих микроорганизмов). Близ-кий ей по структуре и по многим свойствам п-аминобензолсульфамид (антиметаболит п-аминобензойной кислоты) блокирует биосинтез фолата в бактериях, так как его сульфамидная группа не может вступать в реакцию ацилирования с глютаминовой кислотой

Этим определяются бактериостатические свойства стрептоцида и таких сульфамидных препаратов, как, сульфодиметоксин и другие. Животные получают фолат в готовом виде (это витамин В_с), поэтому их клетки не усваивают п-аминобензойную кислоту и стрептоцид для них малотокси-чен. А вот метотрексат транспортируется в клетки животных вместе с фолатом, но связывается с соответствующим апоферментом настолько прочно, что даже без образования ковалентной связи ингибирование им но-сит необратимый характер.

Метотрексат применяют в качестве противоракового средства, а для борь-бы с инфекциями его использовать нельзя (он не попадает в бактери-альные клетки). В то же время, более простые антиметаболиты фолата на основе диаминопиримидина, например, хлоридин и триметоприм пред-ставляют собой антибактериальные препараты:

Еще одни пример использования структурного подобия представлен про-тивотуберкулезным средством п-аминосалициловой кислотой (ПАСК), ко-торая аналогична п-аминобензойной кислоте, но отличается от нее нали-чием «лишней» гидроксильной группы:

и

В этом случае вероятнее всего реализуется иной механизм биологической активности, отличный от антиметаболического, основанного на блокировке активного центра фермента. Транспортная система в мембране микобакте-рий туберкулеза плохо различает эти два вещества и ПАСК попадает в ци-топлазму патогенов, где проявляются цитотоксические свойства этого ве-щества, обусловленные присутствием в его структуре токсофорной феноль-ной группы. В мембранах клеток легочной и других поражаемых палоч-ками Коха тканей транспортная система для п‑аминобензойной кислоты отсутствует, а пассивная диффузия через мембраны идет очень медленно, поэтому ПАСК мало токсична. Правда, эффективность этого противотубер-кулезного средства очень низка, и принимать ПАСК приходится дозами до десятков граммов в день.

Неконкуретное ингибирование имеет место в тех случаях, когда его эф-фективность зависит только от концентрации ингибитора и не зависит от концентрации субстрата. Это означает, что неконкуретные ингибиторы связываются белковой молекулой фермента не в активном центре, а в дру-гом (гр. алло) месте, причем это может быть регуляторный центр алло-стерического фермента или участвующий в перестройке структуры белка «гидрофобный карман». С кинетической точки зрения возможно образова-ние двух заблокированных комплексов по схеме:

или

Поэтому структуры неконкуретных ингибиторов не имеют ничего общего с субстратами и чаще всего их взаимодействие с ферментами носит необ-ратимый характер.

По типу второй реакции протекает и так называемое бесконкуретное инги-бирование, но в этом случае ингибитор вместе с субстратом занимает ката-литический центр.