Імуноблотінг.

Для підтвердження результатів, отриманих методом ІФА, використовують метод імунохімічного аналізу білків, який грунтується на специфічній взаємодії сироваток з електрофаретично розділеними білками вірусу. Принцип метода полягає у тому, що розділені методом електрофарезу білки переносяться на нітроцелюлозні фільтри і потім методом ІФА визначається специфічна взаємодія імунних сироваток з окремими білками віріона. Його основними етапами є: 1) електрофарез вірусних білків в поліакріламідному гелі – гель заливають між скляними пластинами, вірусні білки дисоціюють у буферному розчині та наносять на гель, додавши розчин бромфенолового синього, електрофарез здійснюють в приборі моделі studier та ін. при постійній напрузі потягом 17-18 годин; 2) електроперенос з гелю на нітроцелюлозний фільтр – гель поміщають на нітроцелюлозний фільтр та покривають його з двох боків кількома шарами фільтрувального паперу , “сендвіч” поміщають між катодом та анодом та проводять електроперенос протягом 2 годин; 3) імунодетекція – визначення наявності антитіл до білків ВІЛ у досліджуваних сироватках, цей етап включає блокування вільних місць зв‘язування на нітроцелюлозі, інкубацію з досліджуваною сироваткою, видалення реагентів, що не зв‘язалися, додавання індикаторного комплексу, що містить кон‘югований білок А золотавого стафілокока та пероксидазу хрону, повторне відмивання від зайвих реагентів, проявлення реакції у субстратному розчині з перекису водню та хромогену.

Врахування результатів проводиться візуально за появою пофарбованих смужок на нітроцелюлозі. У хворих на СНІД практично у всіх випадках визначаються антитіла до gp41, а антитіла до р24 меньш часто. У безсимптомних носіїв ВІЛ антитіла до р24 виявляються частіше, ніж антитіла до gp41. При проведенні реакції необхідно використовувати позитивну та негативну сироватки для порівняння з отриманими результатами та для підтвердження правильності постановки реакції.