2.1 . Ацетил холін естерази іммобілізація Використовуючи Ніs - маркер і металухелатну спорідненість

1 . 0,1 М фосфатний буферний розчин ( PBS ) , рН 7,0.

2 . Ацетилхолінестерази ( АХЕ) з Drosophila melanogaster ( GTP технологією , Тулуза , Франція ) : дикого типу та рекомбінантного АХЕ - ( His )₆ . ( АХЕ - WT це розчиннадимеризованаформавидаленаз гідрофобного пептиду при С -кінецьD. melanogaster AChE. AChE-(His)₆походить від АХЕ - WT 3-гістидин заміні петлі від амінокислоти 103 до 136).

3 . Епібромгідрін 98% ( Sigma ) . Увага : високо токсичні та їдкі .

4 . 4 М NaOH розчин .

5 . NiSO4 · 6H₂O ( Aldrich ) .

6 . Метал хелат : хімічне похідне нітрілтриоцтової кислоти ( NTA )N- (5- аміно -1 - карбоксипентил ) імінодіоцтової кислоти , синтезовані з N- бензил - оксікарбоніл - L- лізину у відповідності з процедурою , описаною Hochuli співавт. ,1987 (6).

7 . 1,5 мл мікротруочки Еппендорфа ; піпетки Пастера і колби .

8 . Микроцентрифуги ( Denver Instrument Company ) підходять для 1,5 мл пробірок Еппендорфа для центрифугування суміші діоксиду кремнію - NTA - Ni з ферментного розчину.

9 . градуйований 5- мл пластиковий шприц.

10 . Гідроксіетил - целюлоза ( HEC ) ( Fluka ) .

11 . Графіт , порошок , ( Timcal ) .

12 . 0,1 М фосфатний миючий розчин буферу, рН 7,5 з додаванням 0,1 %Твін -20.

13. 0,2 М NaCl і 2 М MgSO 4 для усунення електростатичних і гідрофобних не специфічних взаємодій .

14. Бичачий сироватковий альбумін (фракція V , Sigma ) , 0,5 % ( вага / об'єм) , підготовлений в PBS, щоб наситити адсорбції сайтів зв'язування білка.

15 . Мала магнітна мішалка . Магнітна мішалка типу AM 3000 D ( Bioblock , Франція )і ванна силіконового масла з контролем температури.

16 . Колба Бюхнера , скляний фільтр , насос і всмоктуючий фільтр.

2.2 . Іммобілізація Глікопротеїнів на підставі Con a спорідненості

Ацетил холін естерази. Іммобілізації на амінованому кварц кремнезері

1 . 0,1 М PBS розчині , рН 7,0 , була доповнена 0,1 М 0,1 М CaCl 2 і 0,1 М MnCl2 .

2 . 0,1 М розчин карбонатного буфера , рН 11,0 .

3 . 1 мг / мл робочих розчинів PBS Con А витяжка з Джека Bean ( Canavalia ensiformis ; див. примітка 1)

4 . AChE (E.C. 3.1.1.7) типу V-S електричного вугра ( Sigma , див. примітку 2).

5 . Метил- α -D- маннопіранозид ( Sigma ) .

6 . Дивініл сульфон ( DVS ) Fluka .

7 . Аміно функціоналізованих кварц кремнезери з 25 - до 40 -мм діаметром LiChroprep

NH2 ( Merck ) були використовані як іммобілізовані носії.

8 . Ацетілтіохолін хлорид ATCH ( Sigma) вихідний розчин готують щодня в

воді (див. примітку 3).

9 . 1,5 мл пробірок Еппендорфа струшують з колбою шейкером SF1 (Stuart Barloworld , Камінь , Великобританія ) , встановити на швидкості 4 .

10 . Капсула міні центрифуги HF- 120 ( Tomy , Kogyo , Японія ) використовується для відокремлення гранул з реакційного середовища.

11 . Вихрові Reax 2000, (Heidolph, Schwabach, Німеччина) був використаний для змішувати мікроколбочок Еппендорфа протягом циклу миття.

3 . Методика

3.1 . Іммобілізація Використовуючи свій маркер і хелат металу Affinity

3.1.1 . Функціоналізація Графіт / гідроксиетилцелюлозної суміші з нітрілоцтової кислоти - Ni і іммобілізація ацетилхолін естерази ( His ) 6 (Див. Примітку 4).

1 . Узагальнити NTA хелат [ NTA похідним N- (5- аміно -1 - карбоксипентил )

імінодиоцтової ] з N - бензилоксикарбоніл - L- лізин згідно з процедурою описуваних Hochuli співавт. 1987; (6).

2 . Перевірити комплексоутворюючі властивості синтезованих NTA і спорідненість зв'язування

AChE - ( His )₆ на колонці з сефарозою завантажений NTA і іонами Ni та врівноважують колонку.

Пластиковий шприц був заповнений сефарозою - NTA - Ni .

3 . Внесять 35 U- AChE ( His ) 6 у NTA на колонці з сефарозою і додають PBS . Збають фракційї 1,5 мл і вимірюють ферментативну активності в кожній фракції для визначення кількості іммобілізованого ферменту.

4 . Модифікована процедура використовується для функціоналізованих графіту / HEC (див. рис. 1 і

Примітка 4) з синтезованим NTA , а потім з Ni (10,11 ) (див. примітку 5).

5 . Активація гідроксильних груп графіт / HEC суміш: в 10 – мл скляну колбу , додають 0,2 г графіту , 0,1 г HEC і 2 мл епібромгідрину . Перемішуючи додають 4 мл 4 % розчину NaOH . Розчин перемішують протягом 4 год при контрольованій температурі умовах ( 30 ° C).

6 . Інтенсивно миють водою до нейтрального рН , з метою усунення можливості перевищення концентрації епібромгідріну і NaOH . Відокремлюють воду з центрифуги і проціджують.

7 . Завантаження з похідним NTA : У кругло донну колбу, що містить отриманий активований графіт / HEC додають 0,1 г NTA похідне , 0,2 г Na₂ CO₃ та 1 мл дистильованої води. Перемішують протягом ночі при 60 ° C. Промивають водою , щоб видалити перевищення NTA . Видалити воду спочатку центрифузі , а потім фільтром.

8 . Комплекси з Ni : промити 1% ( вага / об'єм) Ni^{2 +} розчином.

9. Усунути надлишок Ni промиванням дистильованою водою.

10. Промити 0,1 М фосфатним буфером, рН 7,5, що містить Tween-20, NaClі MgSO4 мінімізації неспецифічних взаємодій.

11. Отриманий графіт / HEC-NTA-Ni може бути використаний для іммобілізації позначений фермент по MCA (11). Отримане функціоналізованих підтримки може бути використаний для побудови ферментного біосенсора, на якому His-мічений фермент може бути іммобилізований (див. рис. 2).

12. Додають розчин 0,5% (м / ж) BSA, щоб наситити сайти зв'язування носіїв доступних для адсорбції ферменту.

13. Додавання розчину His-міченого ферменту підготовленого в PBS, рН 7,0 (див. Примітка 6)від бажаної активності кінцевого застосування ферментної системи.