3.4. Біосенсор з ферментом іммобілізованим за допомогою спорідненості на графічній Гідроксиетилцелюлоза-нітрілоцтовій кислоті-Ni

1. Змішати Графіт-NTA-Ni з графітовим порошком TCNQ (18) (10%) і 1 мл4% (вага / об'єм) HEC.

2. Суміш перемішують протягом 3 год, щоб забезпечити однорідність пасти.

3. Розтерти робочої пасту по робочому електроду поверхні за допомогою трафаретного друку техніку.

4. Зберігати при температурі 4 ° C в сухому стані під вакуумом.

5. Депозит 2 мкл 0,5% (вага / об'єм) розчину БСА.

6. Внести 2 мкл His-мічений ферменту у розчин на бажану активність перед застосуванням електрода.

7. Підготуйте порожній електрод з такою ж кількістю нативного ферменту для оцінки неспецифічної адсорбції і підтвердження специфічноті спорідненості зв'язування.

8. Промийте електрод миючим буфером перед використанням.

3.5. Біосенсор з іммобілізованим ферментом за допомогоюCon a

1. Змішати аміновані нранули з іммобілізованим ферментом з пасти, що містить 150мг графітового TCNQ в 1 мл 4% (вага / об'єм) HEC розчин (див. Примітка 11).

2. Внести вручну і обережно розкатати 1 мкл цієї пасти на поверхню робочого електрода.

3. Сухі електроди зберігати протягом 1 год в атмосфері навколишнього середовища, а потім протягом 2 год у ексикаторі під невеликим вакуумом.

4. Зберігати електроди в запечатаних поліетиленових пакетах в +4 ° C

4 . Примітки

1 . Con розчини готували в PBS , 6 год перед використанням, щоб відбулась реактивація денатурованого лектину Са^{2 +}і Mn^{2 +} (19).

2 . AChE розчиняли в PBS . Малі аліквоти зберігали до першого використання при -18 ° C і після при +4 ° С. АХЕ активність спектрометричного ( 20 ) вимірюється за допомогоюATCH і Ellman реагенту (λ= 412 ) щоразу перед використанням.

3 . Вимірювання активності ферменту повинно бути виконано одразу після додавання субстрату .

4 . HEC був використаний в якості додаткових джерел ОН- груп .

5 . Ця процедура може бути адаптована до будь-якого носія , що містить гідроксильні групи і здатні зв'язуватися з хелат металом.

6 . РН є важливим параметром для спорідненість взаємодій і сильно впливає на ефективність зв'язування . Ці взаємодії , як було показано , є стабільними при нейтральному рН (21). РН від 4,0 до -6,0 видаляє мічені білки і цей принцип може бути використаний для регенерації носія.

7 . Важливо зауважити , що ці процедури регенерації тільки функціоналізованих носіїв і не ферменту. Афінна іммобілізація ферментів міткою 105

8 . До конкуренції з імідазолом , фермент фіксується за допомогою спорідненості і видаляється з носія.

9 . Регенерація з ЕДТА менш бажана , так як іони Ni елюють фермент і додаткове використання носія включає в себе інший заряд з нікелем і потім з ферментом .

10 . Ефективність промивки була випробувана за допомогою поділ гранул з іммобілізованим AChE від 1 мл ATCH 1 М і відсутність кольору , отриманий тест Еллманса.

11 . Розчин HEC отримували шляхом перемішування протягом кількох годин у дистильованої воді за допомогою магнітної мішалки до отримання однорідної, в'язкої розчин. Відповідну кількість графіту - TCNQ було додано до отриманого HEC, а потім перемішували протягом декількох додаткових годин. Суміш витримували при+4 ° С.