Питання для самоперевірки

1. Способи глибинного культивування мікроорганізмів.

2. Що таке “поліауксія”?

3. В чому переваги багатостадійного (“батарейного”) безперервного культивування?

4. Способи і режими стерилізації рідких поживних середовищ.

6. Вимоги до повноцінних за складом рідких поживних середовищ.

7. Фактори, що впливають на інтенсивність синтезу ферментів.

Тема 11. Концентрування та очистка ФП

План

1. Екстрагування ферментів, вакуум-упарювання та висушування ферментних розчинів

2. Осадження ферментів органічними розчинниками і солями

3. Мембранні методи очистки і концентрування ферментних розчинів

4. Адсорбційні методи розділення і очистки ферментів

5. Іммобілізовані ферменти

6. Оцінка якості ферментних препаратів

1. Екстрагування ферментів, вакуум-упарювання

та висушування ферментних розчинів

Культура мікроорганізмів вирощена поверхневим способом і культуральна рідина після глибинного культивування містять велику кількість баластних речовин. В деяких галузях (спиртова, виробництво кожі, сільське господарство) доцільно використовувати неочищені культури мікроорганізмів, бо виділення і очистка ферментів — трудоємкий і дорогий процес. В більшості галузей промисловості і особливо в медицині можна застосовувати лише очищені препарати ферментів.

Вихідним матеріалом для одержання очищених ФП може бути фільтрат культуральної рідини (рідше - біомаса продуцентів) або водний екстракт із поверхневої культури. ФП можуть бути отримані у вигляді рідких концентратів або порошків. На рис. 11.1 зображено принципову схему одержання ФП різного ступеню очистки з використанням різних методів.

При глибинному культивуванні продуценти виділяють основну частину ферментів в культуральну рідину. Нерозчинну частину середовища разом з біомасою виділяють на барабанних вакуум-фільтрах чи сепараторах-кларифікаторах. При поверхневому способі отримання ферментів їх треба екстрагувати із біомаси продуцентів і залишків середовища.

Культура, вирощена поверхневим способом (ПХ)

вода

Екстрагування водою

Розділення (сепарування, фільтрування)

біошрот

Культ. рідина після глибинного культивування (ГХ)

концентрування вакуум-випаровуванням (або ультрафільтрацією)

Сушіння при розпилюванні

Осадження органічними розчинниками чи солями

Сепарування

Теплоносій

Розчинники, солі

Теплоносій

вакуум

Очищений сухий ФП: П10Х, Г10Х

Розчинник на регенерування

Екстракт, що містить ф-ти

Готовий концентрат П2Х, Г2Х (≈ 50 % СР)

Сухий технічний препарат П3Х, Г3Х (W≈ 10 %)

Вологий ФП

Сушіння (сублімаційне розпилювання або в вакуум-шафі)

Розчинення, переосадження, ультрафільтрація (діаліз, сорбція) сушіння тощо

Високоочищений ФП, (-20Х, -30Х)

Рис.11.1. Принципова технологічна схема

одержання технічних та очищених ФП

Всі ферменти - це водорозчинні білки і найкращим екстрагентом для них є вода. Оболонки міцелію грибів мають низький дифузійний опір і екстрагування ферментів з нього проходить легко. А щоб екстрагувати ферменти із дріжджів і бактерій, треба механічним чи автолітичним шляхами розрушити їх клітинні стінки. З технологічних і економічних міркувань екстрагування вигідніше проводити з вологої поверхневої культури: менші втрати активності ферментів і менші витрати теплоти.

На повноту екстрагування ферментів впливають температура, рН, тривалість процесу, природа ферменту, конструктивні особливості апаратів та ін. Важливо відмітити, що при екстрагуванні різні водорозчинні речовини переходять в розчин з неодинаковою швидкістю і проходить їх часткове фракціювання. Оскільки поряд з ферментами в розчин переходить багато баластних речовин, швидкість і повнота екстрагування яких можуть бути більшими, ніж цільового ферменту, то треба вибирати оптимальну тривалість процесу (і свідомо йти на деякі втрати ферменту).

Для отримання концентрованих екстрактів з невеликими втратами ферментів з біошротом (залишком біомаси продуцента) використовують спеціальні екстракційні установи. До недавнього часу використовували дифузійні батареї із 10 диффузорів, кожен з яких працює періодично. В них можна отримати екстракт з вмістом сухої речовини від 7 до 14 %. Вони малопродуктивні, вимагають значних затрат ручної праці, мають місце значні втрати активності ферментів. Ефективнішими є екстрактори безперервної дії фірми "Ніро Атомайзер" (Японія) і фірми "Роунс Даунс" (Великобританія).

Екстракти із поверхневих культур і фільтрати глибинної культури нестійкі при зберіганні. Це напівфабрикати для одержання концентрованих ФП.

В подальшому з них отримують готові технічні ферментні препарати з індексом П2Х чи Г2Х. Найчастіше для цього застосовують вакуум-упарювання. Воно також використовується як один із проміжних етапів одержання більш очищених ФП.

Ферменти дуже чутливі до високих температур, тому процес потрібно вести при низьких температурах і протягом короткого проміжку часу. Для більшості ферментів параметри вакуум-упарювання наступні: залишковий тиск в апараті - 4-5 КПа; температура гріючої пари - 100°С; температура кипіння розчину - 25-30°С. Втрата активності ферментів при цьому становить 10-15%. Вміст сухих речовин (СР) в препараті близько 50%.

Наступною стадією виробництва залежно від поставленої мети може бути висушування ФП. її проводять на розпилювальних сушарках. З точки зору економії теплоти нераціонально висушувати розчини з вмістом СР менше, ніж 18-22%, тому сушінню повинно передувати вакуум-упарювання. Температура теплоносія на вході в сушарку приблизно 130°С, на виході -70°С, а сам порошок прогрівається до 40-45°С. Втрата активності ферментів до 15%. Такі сухі ФП мають індекси ПЗХ чи ГЗХ, їх вологість - 8-10%.