2.5. Лимоннокислий цикл (цикл дикарбонових і трикарбонових кислот)

Двовуглецеві фрагменти у вигляді СН₃СО~SКоА, що утворюються в процесі обміну вуглеводів, жирів і азотистих сполук, перетворюються за так званим лимоннокислим циклом або циклом дикарбонових і трикарбонових кислот.

Вважають, що цикл дикарбонових і трикарбонових кислот є найвірогіднішим шляхом окиснювального перетворення проміжних продуктів розщеплення органічних сполук. Внаслідок цього складного процесу в клітинах весь час утворюються і перетворюються одна в одну ряд три- та дикарбонових кислот, звідки походить і назва циклу- цикл ди- і трикарбонових кислот. Можливість окиснення органічних сполук за допомогою такого механізму вперше довів Кребс, у зв'язку з чим цикл має ще назву циклу Кребса.

Коли говорять про цикл трикарбонових кислот як про загальний окиснювальний шлях органічних сполук, то це не означає, що до цього не відбувалось окиснення органічних сполук. Так, вуглеводи до включення в цикл трикарбонових кислот проходять дві стадії окиснення, а саме:

1) В анаеробних умовах у реакціях гліколізу з 3-фосфогліцеринальдегіду утворюється 3-фосфогліцеринова кислота.

2) В аеробних умовах внаслідок окиснювального декарбоксилювання з піровиноградної кислоти утворюється ацетил~КоА.

Жири при перетворенні жирних кислот на ацетил-КоА також проходять дві стадії окиснення:

1) Жирна кислота ,-ненасичені жирні кислоти;

2) (-окси) жирна кислота  (-кето) жирна кислота.

Утворений з нейтральних жирів гліцерин зазнає ще одного окиснювального перетворення:

-гліцерофосфат  тріозофосфат.

Утворений тріозофосфат вступає в загальний процес використання вуглеводів.

Амінокислоти також перш ніж вступити в цикл трикарбонових кислот, повинні включитися в реакції переамінування або ж окиснювального декарбоксилювання, а потім внаслідок відповідних реакцій також утворити СН₃СО~SКоА.

Внаслідок таких перетворень вуглеводів, ліпідів і азотистих сполук утворюється активний ацетил у вигляді СН₃СО~SКоА, який є загальним продуктом метаболізму цих органічних сполук. Досить сказати, що 2/3 атомів вуглецю вуглеводів і всі атоми вуглецю жирних кислот, а також приблизно половина атомів вуглецю амінокислот проходять через стадію утворення ацетил-КоА. Підраховано, що при добовій нормі харчування людини, яка складається з 400 г вуглеводів, 70 г жирів і 100 г білків, в її організмі щодоби утворюється 350—400 г ацетил-КоА.

На шляху перетворення органічних сполук до утворення ацетил~КоА використовується лише невелика частина вільної енергії харчових речовин. У процесі гліколізу, наприклад, на шляху від глюкози до молочної кислоти витрачається всього близько 5-7 % вільної енергії вуглеводів.

Так, якщо зміна вільної енергії при повному окисненні глюкози становить-686 ккал/моль, то на шляху перетворення глюкози до двох молекул молочної кислоти витрачається лише -50 ккал/моль або близько 7 %, а на шляху перетворення від однієї молекули піровиноградної кислоти до однієї молекули ацетил-КоА ця енергія становить -60 ккал/моль, тобто близько 9 %.

Значно вищою є зміна енергії на шляху перетворення від однієї молекули пальмітинової кислоти до восьми молекул ацетил-КоА, яка становить-679 ккал/моль, тобто близько 30 % від зміни вільної енергії при повному окисненні пальмітинової кислоти.

Процес повного окиснення ацетил-КоА до СО₂ і Н₂О відбувається за допомогою циклу дикарбонових і трикарбонових кислот, який має основне значення в утворенні енергії в живих організмах. Як і процеси окиснення жирних кислот, цикл Кребса локалізований у мітохондріях, які, таким чином, є енергетичним центром живих клітин.

Сумарна реакція окиснення ацетил-КоА, пов'язана з виділенням великої кількості енергії (-207 ккал/моль), проходить в організмі через ряд проміжних реакцій за участю великої кількості ферментів і є багатоступінчастим процесом. Цикл Кребса є головним шляхом кінцевих перетворень ацетил-КоА; тільки незначна частина його витрачається на ацетилювання холіну, ароматичних амінів та інших побічних продуктів обміну. Більша частина СН₃СО~SКоА вступає в реакцію з оксалоацетатом, починаючи цим самим цикл трикарбонових кислот.

Оксалоацетат у циклі трикарбонових кислот відіграє істотну роль. Він може утворюватися при перетворенні різних органічних субстратів: при окисненні яблучної кислоти, при окиснювальному дезамінуванні аспарагінової кислоти, при карбоксилюванні піровиноградної кислоти. Проте основним джерелом його утворення є процес конденсації піровиноградної кислоти з СО₂.

Утворений цим або іншим способом оксалоацетат вступає в реакцію з ацетил-КоА за участю ензиму цитратсинтази, утворюючи лимонну кислоту, яка є, таким чином, початковою речовиною циклу дикарбонових і трикарбонових кислот, звідки цей цикл дістав назву лимоннокислого циклу, або циклу лимонної кислоти (рис.2.2).

Лимонна кислота перетворюється через цис-аконітову кислоту в ізолимонну.

Реакція каталізується ферментом аконітатгідратазою. Утворена ізолимонна кислота під дією ферменту ізоцитратдегідрогенази окиснюється, внаслідок цього утворюються НАДН₂ і оксалосукцинат:

Утворений оксалосукцинат у результаті декарбоксилювання в присутності цього ж ферменту перетворюється в -кетоглутарову.

Рис. 2.2. Схема перетворень за циклом Кребса: 1 – цитратсинтаза, 2, 3 – аконітатгідратаза, 4, 5 – ізоцитратдегідрогеназа, 6 - -кетоглутаратдегідрогеназний комплекс, 7 – сукциніл-КоА-синтетаза, 8 – сукцинатдегідрогеназа, 9 – фумараза, 10 - малатдегідрогеназа

Наступне перетворення -кетоглутарової кислоти подібне до декарбоксилювання пірувату і відбувається за участю цих самих коферментів (НАД, ліпоєвої кислоти, КоА-SН і тіаміндифосфату - ТДФ).

Каталізується реакція ферментом -кетоглутаратоксидазою:

В утвореному сукциніл-КоА ацильний радикал сукцинату має макроергічний зв'язок. У цьому зв'язку акумулюється енергія, яка вивільняється при окиснювальному декарбоксилюванні -кетоглутарової кислоти. Ця енергія під дією специфічного ферменту сукциніл-КоА-синтетази переходить у макроергічний зв'язок гуанозинтрифосфату, внаслідок цього утворюється янтарна кислота (сукцинат).

Сукцинат у присутності сукцинатдегідрогенази окиснюється до фумарової кислоти:

Фумарова кислота, сполучаючись з водою, перетворюється в яблучну кислоту - малат. Реакція каталізується ферментом фумаратгідратазою.

Нарешті, останнім етапом циклу є окиснення яблучної кислоти в присутності малатдегідрогенази, внаслідок чого виникає оксалоацетат.

На стадії утворення оксалоацетату цикл замикається і знову можливе використання нової молекули ацетил-КоА для синтезу лимонної кислоти (цитрату).

Таким чином, у присутності невеликої кількості оксалоацетату та певних ферментних систем відбувається перетворення великої кількості ацетил-КоА. Уся ця складна система ферментів, яка пов'язана з перенесенням електронів і протонів, локалізована в мітохондріях.

Енергія, яка вивільняється при окисненні лимонної кислоти або ацетил-КоА, зберігається в зв'язках НАДН₂, ФАДН₂ і в ГТФ. Окиснення НАДН₂ і ФАДН₂ призводить до синтезу макроергічних фосфатних зв'язків АТФ. У цьому випадку окиснення субстрату відокремлене від синтезу макроергічних зв'язків.

Утворення АТФ у циклі Кребса спряжене з окисненням киснем повітря через систему дихальних ферментів відновленого НАДН₂ (3 молекули) і однієї молекули ФАДН₂.

Експериментально доведено, що при відновленні однієї молекули НАДН₂ або НАДФН₂ утворюється три молекули АТФ. Отже, усього з 3 молекул НАДН₂ утвориться 3  3 = 9 молекул АТФ.

При відновленні однієї молекули ФАД утвориться 2 молекули АТФ і одна молекула ГТФ (АТФ) синтезується на рівні субстрату при перетворенні сукциніл-КоА в янтарну кислоту. Таким чином, внаслідок перетворення за циклом Кребса 1 молекули ацетил-КоА до СО₂ і Н₂О може синтезуватися до 12 молекул АТФ. У зв'язку з цим, що при окисненні однієї молекули глюкози утворюється 2 молекули піровиноградної кислоти, а отже, і 2 молекули ацетил-КоА, то при перетворенні в циклі Кребса однієї молекули глюкози синтезуватиметься до 24 молекул АТФ. Крім цього, 2 молекули АТФ утворюватимуться на анаеробному етапі (баланс гліколізу) на стадії утворення піровиноградної кислоти при окисненні 3-фосфогліцеринальдегіду до 3-фосфогліцеринової кислоти, і 6 молекул АТФ синтезуватимуться при окисненні двох молекул НАДН₂, що утворюються при окисненні піровиноградної кислоти до ацетил-КоА. Отже, загальний баланс аеробного перетворення 1 моль глюкози становитиме 38 молекул АТФ.

Таким чином, аеробне окиснення органічних субстратів є джерелом максимальної кількості молекул АТФ, в яких акумулюється енергія, що може бути використана організмом для його життєдіяльності.

2.5.2. Біохімічні функції циклу Кребса та його регуляція. Цикл Кребса виконує в організмі людини низку важливих біохімічних функцій, а саме:

а) інтегративну – цикл Кребса є своєрідним метаболічним "колектором", який об'єднує шляхи розпаду вуглеводів, ліпідів і білків:

б) амфіболічну – цикл Кребса виконує подвійну функцію: катаболічну, оскільки в ньому проходить розпад ацетил – КоА, і анаболічну – субстрати цього циклу використовуються для синтезу інших речовин. Так, оксалоацетат йде на синтез аспарагінової кислоти і глюкози, α- кетоглутарат - глутамінової кислоти, сукцинат – гему;

в) енергетичну – в процесі цього обміну утворюється 12 молекул АТФ;

г) водневодонорна - цикл Кребса є основним генератором водню для дихального ланцюга мітохондрій.

Реакції циклу Кребса регулюються на рівні:

1) цитратсинтази (ацетил-КоА та оксалоацетат є активаторами ферменту, інгібіторами ферменту є АТФ, НАДН, сукциніл-КоА);

2) ізоцитратдегідрогенази (АДФ, АМФ) – алостеричні активатори ферменту, іони Са²⁺- активатори ферментного комплексу; АТФ, ГТФ, НАДН, сукциніл–КоА - алостеричні інгібітори);

3) α-кетоглутаратдегідрогеназа (АДФ-активатор ферменту, АТФ, НАДН, сукциніл-КоА – інгібітори ферменту).

2.5.3. Анаплеротичні та амфіболічні реакції циклу Кребса. Анаплеротичні реакції — реакції, що підвищують концентрацію субстратів циклу Кребса, за рахунок утворення їх в інших метаболічних шляхах (зокрема, при обміні амінокислот, пірувату). Внаслідок цих реакцій посилюються катаболічні процеси в організмі.

Субстрати циклу Кребса утворюються в наступних анаплеротичних реакціях:

1. Перетворення амінокислот на дикарбонові кислоти — субстрати ЦТК:

- утворення α-кетоглутарату в реакціях трансамінування;

- утворення оксалоацетату в реакціях трансамінування;

- утворення α-кетоглутарату внаслідок окиснювального дезамінування у глутаматдегідрогеназній реакції;

- утворення сукциніл-КоА внаслідок трансамінування та окиснювального декарбоксилювання ізолейцину, валіну.

2. Утворення оксалоацетату з пірувату в піруваткарбоксилазній реакції:

Піруват + СО₂ + АТФ → Оксалоацетат + АДФ + Фн

У піруваткарбоксилазі коферментом виступає біотин (вітамін Н). За рахунок розщеплення АТФ утворюється проміжний комплекс–фермент-біотин-СОО^-, з якого карбоксильна група переноситься на піруват. Активатором піруваткарбоксилази є ацетил-КоА.

За умов низької внутрішньоклітинної концентрації ацетил-КоА швидкість піруваткарбоксилазної реакції є низькою.

Накопичення ацетил-КоА, що спостерігається при активації катаболічних процесів, стимулює через утворення оксалоацетату цикл трикарбонових кислот та інтенсивність окиснення ацетил-КоА. Утворення оксалоацетату з пірувату під дією піруваткарбоксилази є важливою анаплеротичною реакцією в клітинах печінки та нирок.

Таким чином, при наявності ацетил-КоА і нестачі оксалоацетату стимулюється піруваткарбоксилазна реакція, у результаті більше утворюється оксалоацетату, що забезпечує синтез лимонної кислоти та функціонування циклу.

3. Утворення оксалоацетату з фосфоенолпірувату.

Реакція каталізується фосфоенолпіруваткарбоксикіназою. При цьому відбувається утворення ГТФ за рахунок розщеплення макроергічного зв'язку в молекулі фосфоенолпірувату—метаболіту гліколізу.

Фосфоенолпіруваткарбоксикіназна реакція є анаплеротичною реакцією ЦТК, що має місце в міокарді та інших м'язових тканинах. Ця ж реакція, за умов її перебігу в зворотному напрямку, використовується в процесі синтезу глюкози.

Амфіболічні реакції—реакції, що звикористовують субстрати ЦТК для утворення інтермедіатів, необхідних для біосинтетичних процесів:

Фосфоенолпіруват + СО₂ + ГДФ → Оксалоацетат + ГТФ

Оксалоацетат є проміжним продуктом глюконеогенезу, використовується для синтезу амінокислот.

1) у ролі амфіболічних можуть виступати реакції, обернені до перетворень амінокислот—у цьому разі дикарбонові кислоти, що утворюються в ЦТК, стимулюють процеси білкового синтезу;

2) важливою реакцією глюконеогенезу є утворення фосфоенолпірувату з оксалоацетату та ГТФ за участю фосфоенолпіруваткарбоксикінази за умов її перебігу в напрямку, зворотному до анаплеротичного процесу.

3) використання проміжного продукту циклу лимонної кислоти–сукциніл-КоА - для синтезу гему;

4) α-кетоглутарат, а також тісно пов'язаний з циклом трикарбонових кислот піруват використовуються для синтезу амінокислот.

Використання проміжних продуктів циклу лимонної кислоти з біосинтетичною метою повинно супроводжуватися катаболічною активністю циклу для утворення АТФ, який необхідний для здійснення реакцій анаболізму.

Отже, ЦТК разом з тканинним диханням і окиснювальним фосфорилуванням забезпечує утворення АТФ, об'єднує процеси метаболізму білків, вуглеводів, ліпідів, пов'язує процеси анаболізму та катаболізму.