7.4. Біосинтез дезокирибонуклеотидів
Синтез дезоксирибонуклеотидів відбувається з помітною швидкістю лише в тих клітинах, котрі вступають у S-фазу клітинного циклу та готуються до синтезу ДНК та поділу.
Попередниками дезоксирибонуклеотидів у клітинах є рибонуклеотиди - нуклеозиддифосфати (НДФ) та нуклеозидтрифосфати (НТФ).
За допомогою методу мічених атомів було показано, що їх синтез починається зі шляху прямого відновлення ОН-групи біля біля2-го атома вуглецю рибози в складі рибонуклеотидів. При інкубації мічених попередників (рибонуклеотидів) у безклітинній системі бактерій мітку виявили у складі дезоксирибонуклеотидів. За даними П. Рейхарда, у Е. соli всі 4 рибонуклеозиддифосфати відновлюються у відповідні дезоксіаналоги: дАДФ, дГДФ, дЦЦФ, дУДФ за участі складної ферментної системи.
Хімічні перетворення рибонуклеотидів на дезоксирибонуклеотиди відбуваються за участі рибонуклеотидредуктазного комплексу, який складається з власне рибонуклеотидредуктази (РНР), білка тіоредоксину та тіоредоксинредуктази та зводяться до елементарного акту - відновлення рибози в 2-дезоксирибозу, що вимагає наявності двох атомів водню. Безпосереднім джерелом останніх виявився відновлений термостабільний білок тіоредоксин, що містить дві вільні SН-групи на 108 амінокислотних залишків. Тіоредоксин легко окиснюється з утворенням дисульфідного містка за участі РНР. Для його відновлення в системі є тіоредоксинредуктаза (М. м. 68 000 Да) - специфічний ФАД-вмісний фермент, що вимагає наявності відновленого НАДФН. Позначивши умовно рибонуклеозиддифосфат (РДФ), утворення дезоксирибонуклеотидів можна представити таким чином:
П
Рис. 7.13.
Схема перенесення відновлювальних
еквівалентів від (НАДФ+Н+)
на РДФ:
Е1-ФАДН2
–
тіоредоксинредуктаза;
Т – тіоредуктаза; Е2
– рибонуклеотидредуктаза
1. Перенесення водню від НАДФН + Н+ на ФАД флавінового ферменту тіоредоксинредуктази.
2. Перенесення водню від відновленої тіоредоксинредуктази на SН – групи тіоредоксину.
3. Перенесення водню від відновленого тіоредоксину на SН-групи рибонуклетотидредуктази.
4. Перенесення водню від відновлених SН-груп рибонуклеотидредуктази на НДФ з утворенням дНДФ.
За участі комплексу РНР утворюються дАДФ, дГДФ, дУДФ, дЦДФ, які під впливом НДФ-кіназ перетворюються на дНТФ (рис. 7.14):
дНДФ + АТФ дНТФ + АДФ
Рис.
7.14. Схема синтезу дезоксинуклеозидтрифосфатів
Всі вони (за виключенням дУДФ) беруть безпосередню участь у синтезі ДНК.
7.4.1. Біосинтез тимідилових нуклеотидів. Тимідин-5’-монофосфат (дТМФ) утворюється з дУМФ у реакції, яку каталізує тимідилатсинтаза:
Донором метильної групи в тимідилатсинтазній реакції є Nявляється N5,N10-метилен-ТГФК, яка віддає протон, тому одним з кінцевих продуктів реакції є не тетрагідро-, а дигідрофолієва кислота (ДГФК). Остання відновлюється до ТГФК під дією НАДФН-залежної дигідрофолатредуктази. З утвореного дТМФ шляхом фосфотрансферазних реакцій утворюються дТДФ і ТТФ.
Утворення дУМФ – субстрату тимідилатсинтазної реакції – може відбуватися або шляхом дефосфорилування дУДФ, або гідролітичним дезамінуванням дЦМФ за участі дЦМФ-дезамінази.
«Запасний» шлях синтезу дезоксирибонуклеотидів відбувається в тих клітинах, які здатні до швидкого поділу. Він забезпечує повторне використання тиміну та дезоксицитидину. Під впливом тимідинфосфорилази перебігає наступна реакція:
Тимін + Дезоксирибозо-1-фосфат тимідин + Н3РО4
Далі за участі тимідинкінази відбувається утворення дТМФ:
Тимідин + АТФ дТМФ + АДФ
Дезоксицитидинкіназа каталізує реакцію з використанням дезоксицитидину:
Дезоксицитидин + АТФ дЦМФ + АДФ
7.4.2. Регуляція синтезу дезоксирибонуклеотидів. Рибонуклеотидредуктаза, тимідилатсинтаза та тимідинкіназа – ферменти, активність яких підлягає складній алостеричній регуляції, з допомогою котрої досягається збалансоване утворення дНДФ. Вони здійснюють послідовне відновлення всіх рибонуклеозиддифосфатів: першими відновлюються піримідинові нуклеотиди, а останнім – дАДФ, який фосфорилується в дАТФ. Накопичення останнього повністю припиняє відновлення всіх решти рибонуклеозиддифосфатів.
7.4.3. Інгібітори синтезу дТМФ як протипухлинні препарати. Низка структурних аналогів пуринів і піримідинів, а також фолієвої кислоти є інгібіторами синтезу дезоксирибонуклеотидів. вони блокують реплікацію ДНК і поділ клітин. На сьогодні синтезована низка протипухлинних препаратів, які володіють зазначеними властивостями.
Н
Рис.
7.15. Механізм
протипухлинної дії сполук, що блокують
синтез дТМФ:
Е1-тимідилатсинтаза;
Е2-дигідрофолатредуктаза;
Н4F-тетрагідрофолат
(ТГФК); H2F-дигідрофолат
ФК
Інший препарат - цитозинарабінозид (цитарабін) являє собою сполуку, у котрій залишок рибози заміщений на стереоізомер – арабінозу. Цей препарат використовують у хіміотерапії раку, зокрема, при гострій мієлоцитарній лейкемії. В організмі препарат може перетворюватися на дНТФ, інгібувати ДНК полімерази та знижувати швидкість реплікації.
Структурні аналоги фолієвої кислоти - аміноптерин та метотрексат, будучи конкурентними інгібіторами дигідрофолатредуктази, порушують синтез пуринових нуклеотидів і перетворення дУМФ на дТМФ, знижуючи тим самим внутрішньоклітинну концентрацію субстратів синтезу ДНК і РНК. Їх широко застосовують у хіміотерапії пухлин.