8.2. Етапи та механізми трансляції (біосинтезу білка) в рибосомах

Синтез білка виступає одним із складних біосинтетичних процесів, що вимагає великої кількості ферментів та інших специфічних макромолекул. У клітинах еукаріот в білковому синтезі приймає участь більше 70 різних білків рибосом, не менше 20 ферментів, необхідних для активації амінокислот, особливих факторів ініціації, елонгації і термінації синтезу та приблизно 100 додаткових ферментів, що беруть участь у процесінгу (дозріванні) білків. Якщо врахувати, що для цього процесу необхідно більше 70 видів транспортних і рибосомних РНК, то стане зрозумілим, що синтез поліпептидів вимагає дії майже 300 різних макромолекул.

Одним із глобальних досягнень молекулярної біології являється з’ясування молекулярних основ і тонких механізмів синтезу білка, що містить сотні, а іноді тисячі залишків амінокислот. Механізм синтезу повинен володіти тонкою і точною системою кодування, яка автоматично програмує включення кожного амінокислотного залишку в певне місце поліпептидного ланцюга. Встановлено, що система кодування однозначно визначає первинну структуру, тоді як вторинна і третинна структури білкової молекули визначаються фізико-хімічними властивостями і хімічною структурою радикалів амінокислот у поліпептиді.

У з’ясування молекулярних механізмів синтезу білка певний внесок зробили біохіміки. Так, в лабораторії А. Е. Браунштейна було вперше вказано на участь АТФ в синтезі квазіпептидних зв’язків (на прикладах гіпурової кислоти, глутаміну, глутатіону і ацетаніліду). В. М. Орехович встановив, що перенесення аміноацильних або пептидильних залишків на NH₂-групу амінокислот може здійснюватися не тільки з амідного або пептидного, але й із складноефірного зв’язку. Саме цей механізм лежить в основі реакції транспептидилювання в 50S рибосомі у стадії елонгації синтезу білка.

У синтезі білка, що протікає в основному в цитоплазмі, вирішальну роль відіграють нуклеїнові кислоти, зокрема ДНК. Після того, як було встановлено, що ДНК переносить і зберігає спадкову інформацію, було поставлено питання про те, яким чином ця генетична інформація, записана (зашифрована) в хімічній структурі ДНК, трансформується у фенотипні ознаки і функціональні властивості живих організмів, які передаються по спадковості. В даний час можна дати однозначну відповідь на це питання: генетична інформація програмує синтез специфічних білків, що визначають у свою чергу специфічність структури та функції клітин, органів і цілого організму (рис. 8.20).

Уприроді, як відомо, існує два типи біополімерних макромолекул: так звані неінформативні біополімери (вони представлені мономерами, що повторюються, і/або розгалуженими структурами, наприклад полісахариди, полі-АДФ-рибоза, пептидоглікани, глікопротеїни) та інформативні біополімери, що несуть первинну генетичну інформацію (нуклеїнові кислоти) і вторинну генетичну, точніше фенотипну, інформацію (білки). Ці загальні уявлення можуть бути виражені наступною послідовністю (потік інформації):

Днк → рнк → Білок → Клітина → Організм

Значний внесок у сучасні уявлення про місце, чинники і механізм синтезу білка внесли дослідження Т. Касперсона, М. Хогланда, П. Берга, П. Замечника, С. Очоа, М. Ніренберга, Н. Горовица, Ф. Гауровица, С. Вейсса, А. А. Баєва, А. Н. Білозерського, А. С. Спіріна та інших.

Ще в 40-х роках було встановлено, що ДНК локалізована в ядрі клітини, тоді як синтез білка протікає головним чином в мікросомах цитоплазми. Перші експериментальні докази необхідності нуклеїнових кислот для синтезу білка були отримані в лабораторії Т. Касперсона. Було показано також, що присутні в цитоплазмі рибонуклеїнові кислоти контролюють синтез білків цитоплазми.

Таким чином, вже тоді вимальовувалася картина тісного зв’язку між ДНК, локалізованою в ядрі (отримані експериментальні дані про наявність ДНК також у мітохондріях - приблизно 1- 2 % від сумарної ДНК клітин), і синтезом білка, що протікає в цитоплазмі та регулюється рибонуклеїновими кислотами, які були відкриті як в цитоплазмі, так і в ядрі. На основі цих морфологічних даних було зроблено висновок, що біосинтез білка, хоч безпосередньо й регулюється рибонуклеїновими кислотами, опосередковано пов’язаний з контролюючим впливом ДНК ядра і що РНК спочатку синтезується в ядрі, потім поступає в цитоплазму, де виконує роль матриці в синтезі білка.

У послідовності ДНК → РНК → Білок (цю тезу називають центральною догмою (постулатом) молекулярної біології) бракувало відомостей про те, яким чином відбувається розшифрування спадкової інформації і синтез специфічних білків, що визначають різноманітність ознак живих істот. У даний час з’ясовані основні процеси, за допомогою яких здійснюється передача спадкової інформації: р е п л і к а ц і я, тобто синтез ДНК на матриці ДНК; т р а н с к р и п ц і я, тобто синтез РНК на матриці ДНК або переклад мови і типу будови ДНК на молекулу РНК і т р а н с л я ц і я процесу, в якому генетична інформація, що міститься в молекулі мРНК, направляє синтез відповідної амінокислотної послідовності в білку.

Д

еякі онкогенні РНК – вмісні віруси тварин, такі як вірус саркоми Рауса мають фермент – РНК – залежну ДНК – полімеразу, яку часто називають зворотною транскриптазою. Після того як вірус попаде в клітину-господаря цей фермент здатний каталізувати синтез ДНК, комплементарної до вірусної РНК, яка відіграє при тому роль матриці. Ця ДНК вбудовується в геном еукаріотичної клітини- господаря, де вона може на протязі багатьох поколінь залишатися в скритому стані. При певних умовах такі недіяльні вірусні гени можуть активуватися і викликати реплікакцію віруса. Наявність зворотних траскриптаз довело можливість передачі генетичної інформації в напрямку від РНК до ДНК. Воно дозволило представити яким чином включаються в геном клітини - господаря онкогени, які знаходяться в РНК- вмісних вірусах у вигляді РНК. Виходячи з цього, прийшлося по-іншому сформулювати центральну догму молекулярної біології (рис.8.21.).

РНК- вмісні віруси за рахунок зворотної траскриптази називають ретровірусами ("ретро" з латинської мови означає "назад").

Виявлення зворотної транскриптази дозволило відповісти на питання: як генетична інформація онкогенних РНК – вмісних вірусів може включатися в ДНК клітини – господаря. Ці дослідження дозволяють припустити, що гени деяких РНК – вмісних вірусів на ранніх етапах біологічної еволюції цих видів, транскрибувалися в ДНК і вбудувалися в хромосоми предків цих тварин. Після цього вони передавалися із покоління в покоління при реплікації всієї ДНК клітини, в тому числі і наявних у ній онкогенів, які спочатку належали вірусній РНК.

Такі онкогени звичайно не транскрибуються, але якщо їх активувати, наприклад,дією канцерогенних агентів, то вони транскрибуються і транслюються з утворенням продуктів, які

викликають трансформацію нормальних клітин людини у злоякісні.

У

деяких бактеріофагівE. coliхромосома являє собою не ДНК, а РНК. Рибонуклеїнові кислоти таких вірусів, які при синтезі вірусних білків виступають у ролі мРНК, реплікуються в клітину – господаря під дією ферментів, які називають РНК - залежними РНК – полімеразами, або репліказами. Ці ферменти відсутні в клітинахE. coliі появляються в них лише у відповідь на присутність у них вірусних РНК. Репліказа РНК каталізує утворення РНК, комплементарної вірусній РНК. Так, РНК – репліказа фага здатна використовувати як матрицю тільки РНК цього віруса, а РНК клітини- господаря цим ферментом не реплікуються. З цього випливає, що центральна догма молекулярної генетики може бути сформульована в дещо зміненій формі, приведеній на (рис.8.22).

8.2.1. Трансляція і загальні вимоги до біосинтезу білка у безклітинній системі. Безпосереднє відношення до механізмів передачі спадкової інформації, або експресії генів, має процес трансляції (синтезу білків у рибосомах). У даний час відомо, що процес біосинтезу білка протікає у п’ять основних стадій, кожна з яких вимагає ряду компонентів. У таблиці (табл.8.1.) перераховані компоненти, необхідні для синтезу білка в Е.coli та інших прокаріотів. Синтез білка в еукаріотів протікає в основному за цією схемою, але дещо відрізняється в деталях.

Таблиця 8.1. Склад білоксинтезуючої системи в про - і еукаріотів у різні стадії синтезу білка

Стадія	Прокаріоти	Еукаріоти
1. Активування амінокислот	20 амінокислот 20 аміноацил – тРНК- синтетаз Мінімум 20 тРНК АТФ і Мg^2+	20 амінокислот 20 аміноацил – тРНК- синтетаз Мінімум 20 тРНК АТФ і Мg^2+
2. Ініціація	мРНК Ініціююча аміноацил-тРНК (N- – формілметіоніл-тРНК) Ініціюючий кодон у молекулі мРНК (АУГ) 30S і 50S рибосомні субчастини Фактори ініціації: ІF-1, ІF-2, ІF-3, ГТФ і Мg^2+	мРНК Ініціююча аміноацил-тРНК (N– метіоніл-тРНК) Ініціюючий кодон у молекулі мРНК (АУГ) 40S і 60S рибосомні субчастини Фактори ініціації: еІF-1, еІF-2, еІF-2А еІF-3, еІF-4А еІF-4В, еІF-4С, еІF-4D, фактор, що розпізнає кеп, ГТФ і Мg^2+
3. Елонгація	Ініціюючий комплекс (функціональна 70S рибосома) Специфічні тРНК, які визначаються кодонами Фактори елонгації: ЕF-Tu, EF-Ts, EF-G, ГТФ, Mg^2+	Ініціюючий комплекс (функціональна 80S рибосома) Специфічні тРНК, які визначаються кодонами Фактори елонгації: еЕF-1α, EЕF-1αβγ, еЕF-2, ГТФ і Mg^2+
4. Термінація	Термінуючі кодони у молекулі мРНК: УАА, УГА і УАГ Фактори термінації (рилізінг фактори): RF-1, RF-2, RF-3, АТФ	Термінуючі кодони у молекулі мРНК: УАА, УГА і УАГ Фактори термінації (рилізінг фактори): еRF, АТФ
5. Процесинг у формуванні третинної структури	Специфічні ферменти і кофактори, які викликають звільнення ініціюючих залишків й сигнальних послідовностей, обмежений протеоліз та хімічну модифікацію	Специфічні ферменти і кофактори, які викликають звільнення ініціюючих залишків й сигнальних послідовностей, обмежений протеоліз та хімічну модифікацію

У сучасних уявленнях про синтез білка видатну роль зіграли три експериментальні підходи, розроблені на початку 50-х років.

По-перше, в класичних дослідженнях П. Замечника при використанні мічених амінокислот було вперше вирішено питання про місце синтезу білка; ним виявилася рибосома.

При введенні щурам ¹⁵N - амінокислот і визначенні радіоактивності білків у різних субклітинних фракціях печінки, отриманих методом диференційного центрифугування через різні проміжки часу, було показано, що радіоактивна мітка в першу чергу з’являється у фракції мікросом і лише потім в інших субклітинних утвореннях.

Другим відкриттям М. Хогленда і П. Замечника встановлено, що інкубація амінокислот з АТФ і цитозольною фракцією клітин печінки призводить до активації амінокислот, які приєднуються до тРНК.

Так, додавання АТФ до білоксинтезуючої системи цитозолю викликало „активування” амінокислот та зв’язування їх з термостабільною і розчинною формою РНК, згодом названою тРНК, що призводило до утворення комплексу, названого пізніше аміноацил-тРНК. Ферменти, які каталізують цей процес, називають аміноацил-тРНК-синтетазами.

Третє відкриття належить Ф. Кріку, який з’ясував, що тРНК виконують у даному процесі роль адаптора. При цьому одна частина молекул тРНК може зв’язуватися зі специфічною амінокислотою, а інша її частина – розпізнавати в мРНК коротку нуклеотидну послідовність, яка кодує цю амінокислоту. Отже, з’ясована роль адапторних РНК у процесі трансляції.

Подальші дослідження були направлені на пошук інших компонентів білоксинтезуючої системи.

Білоксинтезуюча система включає набір всіх 20 амінокислот, що входять до складу білкових молекул; набір не менше 20 різних ферментів - аміноацил-тРНК-синтетаз; рибосоми (точніше, полісоми, що складаються з 4 - 12 монорибосом з приєднаною до них мРНК); понад 70 (40S і 30S) різних рибосомних білків, більше 10 білкових факторів ініціації, елонгації і термінації синтезу поліпептидних ланцюгів, понад 70 видів транспортних і рибосомних РНК; АТФ і АТФ - генеруючої системи ферментів; ГТФ, що бере специфічну участь у стадіях ініціації та елонгації синтезу білка в рибосомах; іони Мg²⁺; мРНК як головного компоненту системи, білкові чинники, які беруть участь у синтезі на різних рівнях трансляції, близько 100 ферментів, які каталізують реакції посттрансляційних модифікацій білків. Основні компоненти білоксинтезуючої системи про - і еукаріотів у різні стадії синтезу білка узагальнені в табл. 8.1.

Розглянемо детальніше структуру і функцію головних компонентів білоксинтезуючої системи.

8.2.2. Рибосоми. Живі організми, залежно від структури клітин, поділяють на дві групи-про - та еукаріоти. Перші не містять обмеженого мембраною ядра і мітохондрій або хлоропластів; вони представлені головним чином мікроорганізмами. Клітини еукаріот тварин і рослин, навпаки, містять ядра з мембранами, а також мітохондрії (у ряді випадків і хлоропласти) та інші субклітинні органели.

Обидва типи клітин мають рибосоми, причому рибосоми еукаріот (М. м. 4,2·10⁶) значно більшого розміру (23 нм в діаметрі), ніж рибосоми прокаріот (М.м. 2,5-10⁶, 8 нм у діаметрі). Рибосоми характеризують за швидкістю їх седиментації в центрифужному полі, яка кількісно виражається константою седиментації s в одиницях Сведберга S. Величина s залежить не тільки від розміру частинок, але і від форми та щільності, так що вона непропорційна розміру. Число рибосом у мікробній клітині дорівнює приблизно 10⁴, а еукаріот- 10⁵. У кожній клітині E. сoli міститься більше 15 000 рибосом, які становлять майже ¼ частини сухої маси клітини.

За будовою рибосоми є нуклеопротеїни, що складаються з РНК і білків, причому 80S рибосоми еукаріот містять приблизно однакову їх кількість, а у 70S рибосом прокаріот співвідношення РНК і білка складає 65 % і 35 % відповідно (8.23). РНК рибосом прийнято називати рибосомними і позначати рРНК. Як 80S , так і 70S рибосоми складаються з двох субодиниць, які можна побачити під електронним мікроскопом або після обробки рибосом розчинами, що містять низькі концентрації іонів Мg²⁺. За цих умов рибосоми дисоціюють на субодиниці; останні можуть бути відокремлені одна від одної методом ультрацентрифугування.

Так, у 70S рибосом величини S для субодиниць дорівнюють 50S і 30S, у 80S рибосом - відповідно 60S і 40S (рис. 8.23). Вкажемо також, що у Е. соli велика та мала субодиниці містять 34 білки і 21 білок відповідно і, крім того, 2 молекули рРНК з коефіцієнтами седиментації 23S і 5S у великій і одну молекулу рРНК (16S) у малій субодиниці. Рибосомні білки не тільки всі виділено, але і секвеновано; відрізняються молекулярною масою (від 6 000 до 75 000 Да).

Вважається, що всі 55 білків рибосом бактерій беруть участь у синтезі поліпептидів як ферменти або структурні компоненти, але, за винятком невеликого числа, детальна функція більшості з них не з’ясована. РНК 23S і 5S містять 3200 і 120 нуклеотидів відповідно, а 16S РНК - 1540 нуклеотидів. Субодиниці рибосом клітин еукаріот побудовані складніше. У їх складі чотири різні рРНК і більше 70 різних білків в обох субодиницях, при цьому велика субодиниця (60S) містить три різні рРНК: 28S (4700 нуклеотидів), 5,8S (160 нуклеотидів) і 5S (120 нуклеотидів) -і близько 49 білків. Мала субодиниця (40S) містить всього одну молекулу 18S рРНК і близько 33 білків.

Біологічні функції компонентів рибосом також зв’язані, найімовірніше, з синтезом поліпептидного ланцюга, але їх конкретна роль недостатньо розкрита. Рибосоми є складною молекулярною системою синтезу білка. Для з’ясування тонких механізмів синтезу білка в рибосомах необхідні точніші відомості про структуру і функції всіх компонентів рибосом.

О

Рис. 8.23. Схема будови рибосом прокаріот і еукаріот

станнім часом з’ясовано, що форму і розміри 30S і 40S субодиниць рибосом зумовлюють не білкові молекули цих частинок, а третинна структура, що входять в їх склад 16S і 18S рРНК. Згідно даних акад. А. С. Спіріна, для збереження просторової морфологічної моделі всіх 30S субодиниць виявилася достатньою наявність тільки двох білків, що містяться в певних ділянках молекули 16S рРНК.

Відомо, що рРНК утворюється із загального попередника всіх типів клітинних РНК, що у свою чергу синтезується на матриці ДНК в ядрі. Білки рибосом синтезуються в цитоплазмі, потім транспортуються в ядерця, де і відбувається спонтанне утворення субодиниць рибосом шляхом об’єднання білків з відповідними рРНК. Об’єднані субодиниці транспортуються через пори ядерної мембрани назад в цитоплазму, де група рибосом разом з мРНК утворює полісоми або полірибосоми, що беруть безпосередню участь у синтезі білка.

8.2.3. Матрична РНК. У ряді лабораторій (зокрема, в лабораторії С. Бреннера) було отримано дані про можливість існування в клітинах у сполученні з рибосомами короткоживучої РНК, названою інформаційною (іРНК). Тепер вона позначається як матрична РНК (мРНК), тому що її роль полягає в перенесенні інформації від ДНК в ядрі (де вона синтезується під дією ДНК-залежної РНК-полімерази) до цитоплазми, де вона з’єднується з рибосомами і служить матрицею, на якій здійснюється синтез білка. Ця гіпотеза потім експериментально була доведена в лабораторії М. Ніренберга.

При вивченні впливу різних фракцій клітинної РНК на здатність рибосом, виділених з Е. соli, до синтезу білка було встановлено, що деякі з них стимулювали включення ¹⁴С-амінокислот у поліпептид, що синтезувався. Додавання синтетичного полінуклеотиду, зокрема поліуридилової кислоти (полі-У), у білоксинтезуючу систему призводило до включення в білкову молекулу, що синтезується, єдиної амінокислоти - фенілаланіну. Полі-У викликав синтез у безклітинній системі незвичайного поліпептиду поліфенілаланіну. Таким чином, штучно синтезований полірибонуклеотид, доданий до рибосом, що включали відомі на той час чинники білкового синтезу і джерела енергії, викликав синтез певного, запрограмованого поліпептиду.

Ці досліди відкрили можливість для експериментального розшифрування всього генетичного коду, за допомогою якого інформація від РНК передається на білок, що синтезується. Послідовність нуклеотидів РНК реалізується в специфічній послідовності амінокислот поліпептидного ланцюга, що синтезується. Досліди М. Ніренберга свідчать також про те, що не рибосома і не рибосомна рРНК є матрицею, на якій синтезуються специфічні білки, а цю роль виконують мРНК, що поступають ззовні. Отже, ДНК передає інформацію на РНК, яка синтезується в ядрі, а потім поступає в цитоплазму; тут РНК виконує матричну функцію для синтезу специфічної білкової молекули. Матрична гіпотеза білка, як і інших полімерних молекул ДНК і РНК, в даний час отримала підтвердження. Її підтвердження було доведено в експериментах, які забезпечували точне відтворення первинної структури білків. Цей синтез на відміну від хімічного синтезу відрізнявся не тільки високою швидкістю і специфічністю, але і спрямованістю самого процесу в строгій відповідності з програмою, записаною в лінійній послідовності молекули матриці.\

8.2.4. Біосинтез рибосомних РНК. У прокаріот синтез 23S, 16Sі 5Sрибосомних (рРНК) здійснюється з 30Sпопередника, що одержав назву прерибосомної РНК (пре-рРНК). Під дією специфічних нуклеаз і метилазізцього попередникавнаслідокпроцесингу спочатку утворюються проміжні рибосомні РНК, які піддаються подальшій нуклеазній атаці та метилюванню, перетворюються на зрілімолекули (рис. 8.24.).

Для ряду клітин еукаріотів доведена транскрипція двох високомолекулярних рРНК (18S і 28S) і однієї низькомолекулярної рРНК (5,8S) з попередника (45S); останній є продуктом генів рРНК, яких більше тисячі копій містить клітина. Первинний транскрипт 45S рРНК високометильований, причому метилюванню в ядрах піддаються тільки ці ділянки первинного транскрипту, з яких у процесі реакцій процесингу утворюються рРНК. Сам механізм процесингу первинного транскрипту відрізняється від процесингу гяРНК при утворенні мРНК. Молекула, що утворилася, наприклад, 28S рРНК ще в ядрі піддається подальшому метилюванню, потім вона взаємодіє з синтезованими в цитоплазмі рибосомними білками і формується 60S рибосомна субодиниця; 18S рРНК аналогічним способом беруть участь у формуванні 40S рибосомної субодиниці. Обидві субодиниці стабільні в клітинах, що діляться, і нестабільні в клітинах, які не діляться.

8.2.5. Природа генетичного коду. Проблема синтезу білка тісно пов’язана з поняттям генетичного коду. Генетична інформація, закодована в первинній структурі ДНК, ще в ядрі переводиться в нуклеотидну послідовність мРНК. Питання про те, яким чином ця інформація передається на білкову молекулу, довго не було з’ясованим.

Клітини еукаріот мають особливий механізм точного і ефективного перекладу послідовності мРНК у відповідну послідовність амінокислот білка, що синтезується. Самі молекули мРНК не мають спорідненості до амінокислот, і було висловлено припущення про те, що для перекладу нуклеотидної послідовності мРНК на амінокислотну послідовність білків необхідний якийсь посередник, названий адаптером.

Молекула адаптера повинна має здатність дізнаватися про нуклеотидну послідовність специфічної мРНК і відповідну амінокислоту. Клітина, що має подібну адапторну молекулу, може вбудовувати кожну амінокислоту у відповідне місце поліпептидного ланцюга в строгій відповідності з нуклеотидною послідовністю мРНК. Залишається, таким чином, непорушним положення, що самі по собі функціональні групи амінокислот не здатні вступати в контакт з мРНК.

Було показано, що в нуклеотидній послідовності мРНК є кодові „слова” для кожної амінокислоти - генетичний код. Найімовірніше, він полягає в певній послідовності розташування нуклеотидів в молекулі ДНК. Питання про те, які нуклеотиди відповідальні за включення певної амінокислоти в білкову молекулу і яку кількість нуклеотидів визначає це включення, залишалися невирішеними до 1961 р. Теоретичний аналіз показав, що код не може складатися з одного нуклеотиду, оскільки в цьому випадку тільки 4 амінокислоти можуть кодуватися. Проте код не може бути і дуплетним, тобто комбінація двох нуклеотидів з чотирьохбуквеного „алфавіту” не може охопити всіх амінокислот, оскільки подібних комбінацій теоретично можливо тільки 16 (4² = 16), а до складу білка входить 20 амінокислот. Для кодування всіх амінокислот білкової молекули був би достатнім триплетний код, коли число можливих комбінацій складе 64 (4³ = 64).

З приведених даних М. Ніренберга стає очевидним, що полі-У, тобто РНК, що гіпотетично містить залишки тільки одного уридилового мононуклеотиду, сприяє синтезу білка, побудованого із однієї амінокислоти – фенілаланіну. На цій основі був зроблений висновок, що кодоном для включення фенілаланіну в білкову молекулу може служити триплет, що складається з трьох уридилових нуклеотидів-УУУ. Незабаром було показано, що синтетична матрична поліцитидилова кислота (полі-Ц) кодує утворення поліпроліну, а матрична поліаденілова кислота (полі-А) -полілізину; відповідні триплети ЦЦЦ і ААА дійсно виявилися триплетами (кодонами) для кодування проліну і лізину.

Незабаром в лабораторіях М. Ніренберга, С. Очоа и Г. Хорана, користуючись цими штучно синтезованими мРНК, були отримані докази не тільки складу, але і послідовності триплетів всіх кодонів, відповідальних за включення кожної з 20 амінокислот у білкову молекулу.

Було встановлено, що з 64 комбінацій нуклеотидів 61 кодон є змістовним, тобто таким, що визначає включення до складу білка певної амінокислоти, а три кодони, а саме УАГ, УАА, УГА, – беззмістовними, які не кодують жодної амінокислоти, вони були названі нонсенс-кодонами. Проте ці кодони не позбавлені сенсу, оскільки принаймні два з них виконують важливу функцію сигналів термінації в синтезі поліпептиду в рибосомах (функцію закінчення, термінації синтезу).

8.2.5.1. Властивості генетичного коду. Генетичний код для амінокислот є виродженим. Це означає, що значна більшість амінокислот кодуються декількома кодонами. За винятком метіоніну і триптофану, решта всіх амінокислот має більше, ніж один специфічний кодон. Розпізнавання кодону мРНК антикодоном тРНК грунтується не тільки на спаровуванні основ, коли кожна основа кодону утворює пару основ з комплементарною азотистою основою антикодону. В цьому випадку кожен антикодон, відповідно кожна молекула тРНК, може в принципі розпізнавати тільки один кодон мРНК. Є дані про те, що деякі тРНК можуть кодуватися більше, ніж одним кодоном. Зокрема, показано, що аланінова тРНК, виділена з дріжджів, кодується 3 кодонами: ГЦУ, ГЦЦ і ГЦА. Як видно, відмінності стосуються тільки природи 3-го нуклеотиду. У зв’язку з цим була висунута гіпотеза „гойдань”, яка припускає, що на спаровування 3-ої основи, очевидно, необхідні менші обмеження, що є, найімовірніше, однією з причин виродженості генетичного коду.

Виродженість коду виявляється неоднаковою для різних амінокислот. Так, якщо для серину, аргініну і лейцину є по 6 кодових „слів”, то ряд інших амінокислот, зокрема глутамінова кислота, гістидин і тирозин, мають по 2 кодони, а триптофан - тільки 1. Цілком допустимо тому припущення, що послідовність перших двох нуклеотидів визначає в основному специфічність кожного кодону, тоді як 3-й нуклеотид, очевидно, менш суттєвий.

Виродженість генетичного коду має безперечний біологічний сенс, що забезпечує організму ряд переваг. Зокрема, вона сприяє „вдосконаленню” геному, оскільки в процесі точкової мутації, викликаної хімічними або фізичними чинниками, можливі різні амінокислотні заміни, найбільш цінні з яких відбираються в процесі еволюції.

Іншою відмінною особливістю генетичного коду є його безперервність, відсутність „розділових знаків”, тобто сигналів, які вказують на кінець одного кодону і початок іншого.

Генетичний код є лінійним, однонаправленим і таким, що непереривається: АЦГУЦГАЦЦ. Ця властивість генетичного коду забезпечує синтез з точною і надзвичайно впорядкованою послідовністю амінокислотних залишків у молекулі білка. Інакше послідовність нуклеотидів у кодонах буде порушена і призведе до синтезу „беззмістовного” поліпептидного ланцюга із зміненою структурою і непередбачуваною функцією. Слід вказати ще на одну дуже важливу особливість коду – його універсальність для всіх живих організмів від Е. соli до людини. Код не піддався істотним змінам за мільйони років еволюції.

Генетичний код є таким, що не перекривається – після зчитування інформації з одного триплету „рамка зчитування переміщується вправо на три нуклеотиди”.

8.2.6. Процеси трансляції. Синтез білка є циклічний енергозалежний багатоступеневий процес, в якому вільні амінокислоти з’єднуються в генетично детерміновану послідовність з утворенням поліпептидів. Система білкового синтезу, або система трансляції, включає участь безлічі різноманітних молекул (низькомолекулярні речовини і макромолекули, а також надмолекулярні структури). У табл. 8.1. узагальнені дані про склад білоксинтезуючої системи у про- і еукаріот у кожній з 5 стадій синтезу, з яких 3 стадії (ініціація, елонгація і термінація) по аналогії із стадіями синтезу полімерних молекул ДНК і РНК вважаються головними, а 2 стадії (активація амінокислот і постсинтетичний процесінг) розглядаються як допоміжні стадії синтезу.

Більше 100 макромолекул бере участь в активуванні амінокислот і їх перенесенні на рибосоми (всі тРНК, аміноацил-тРНК-синтетази), більше 60 макромолекул входить до складу 70S і 80S рибосом, і близько 10 макромолекул, які названі білковими чинниками, беруть безпосередню участь у системі трансляції. Перш за все, за допомогою ізотопного методу було з’ясовано, що синтез білка починається з N-кінця і завершується С-кінцем, тобто процес протікає у напрямі NН₂ → СООН.

Білковий синтез, або процес трансляції, може бути умовно роздільний на п’ять стадій, з яких дві вважаються підготовчими, зокрема активування амінокислот і постсинтетична модифікація білкової молекули, і три стадії складають власне трансляцію.

Багатоступеневий матричний синтез білка, або власне трансляцію, що протікає в рибосомах, також умовно ділять на три стадії: ініціацію, елонгацію і термінацію.

8.2.6.1. Ініціація трансляції. Стадія ініціації, що є „точкою відліку” початку синтезу білка, вимагає дотримання ряду умов, зокрема наявності в системі, крім 70S (або 80S) рибосом, ініціаторної аміноацил-тРНК (аа-тРНК), ініціюючих кодонів у складі мРНК та білкових чинників ініціації. Експериментально доведено, що синтез білка ініціює єдина амінокислота - метіонін.

У всіх живих організмах відкриті дві тРНК для метіоніну: одна використовується при ініціації синтезу білка, друга - для включення метіоніну у внутрішню структуру поліпептиду, що синтезується, у стадії елонгації. Відповідно ці тРНК прийнято позначати тРНК^фМет і тРНК^Мет. Клітини еукаріот не потребують утворення формілметіоніну.

У прокаріот синтез N-формілметіонін – тРНК протікає у дві стадії: Дану стадію каталізує метіоніл-тРНК-синтетаза. Реакція потребує енергії гідролізу АТФ.

Трансформілаза, що каталізує II стадію, виявилася більш специфічною, ніж метіоніл-тРНК-синтетаза: вона не активує формілювання ні вільного метіоніну, ні метіоніну в комплексі з тРНК^Мет.

Таким чином, N – формілметіоніл-тРНК є першою аа-тРНК, яка визначає включення N - кінцевого залишку амінокислоти і тим самим початок трансляції. Процес формілування має важливий хімічний і біологічний сенс: блокуючи участь NН₂-групи метіоніну в утворенні пептидного зв’язку, він забезпечує тим самим синтез білка у напрямі NН₂ → СООН; формілметіоніл- тРНК, що утворилася, крім того, першою зв’язується з певною ділянкою 30S субодиниці рибосоми і з мРНК.

Необхідною умовою ініціації, як було відмічено, є також наявність кодонів ініціації, які кодують формілметіонін. У бактерій цю функцію виконують триплети АУГ і ГУГ мРНК. Проте вони кодують формілметіонін (або початковий метіонін у клітинах еукаріот) тільки тоді, коли вони є початковими триплетами при зчитуванні мРНК.

З‘ясована природа білкових чинників ініціації. У Е. соli (див. табл.8.1.) відкриті три чинники ініціації, які позначають відповідно 1F-1, 1F-2, 1F-3. Вони отримані ; у очищеному стані із молекулярними масами 9 000, 10 000 і 22 000 Да відповідно. Чинник 1F-3 забезпечує розпізнавання ділянки на молекулі мРНК, до якої приєднується формілметіоніл-тРНК. Даний білковий чинник першим зв’язується з вільною 30S субодиницею рибосоми і перешкоджає асоціації 30S і 50S субодиниць у 70S рибосому без молекули мРНК. Чинник 1F-1 сприяє зв’язуванню ініціаторної формілметіоніл-тРНК з комплексом 30S субодиниць і мРНК. Білковий чинник 1F-2, найімовірніше, сприяє об’єднанню 30S і 50S субодиниць після того, як на першій субодиниці вже присутні ініціюючі кодони мРНК, N - формілметіоніл-тРНК, 1F-3, 1F-1 і ГТФ. Цей білок розглядають як чинник стабілізації всього ініціюючого 70S комплексу.

Аналогічні білкові чинники ініціації виявлені також у клітинах еукаріот. Відкрито близько 10 білкових чинників ініціації (табл.8.1.), їх прийнято позначати еlF-2, elF-3 i elF-5. Вони отримані в чистому вигляді: еlF-2 складається з α-, β - і γ-субодиниць (М. м. 38 000, 47 000 і 50 000 Да відповідно), elF-3 (М.м. 500 000 – 700 000 Да) і elF -5 (М.м. 125 000 Да). У синтезі білка їх роль тотожна ролі ініціюючих білків у прокаріот. Особливістю синтезу білка у еукаріот є, крім того, наявність серед 10 білкових чинників ініціації ще одного кеп-зв’язуючого білка. Цей білок сприяє утворенню комплексу між мРНК і 40S рибосомною субодиницею.

У

Рис. 8.25. Схема утворення ініціюючого

комплексу

т в о р е н н я і н і ц і ю ю ч о г о к о м п л е к с у. Експериментально доведено, що в процесі білкового синтезу спостерігається постійна дисоціація 70S рибосом на 30S і 50S субодиницi та подальша їх реасоціація (рис. 8.25.). Спочатку утворюється ініціюючий комплекс шляхом приєднання білкових чинників, формілметіоніл-тРНК і ГТФ до 30S субодиниці, до якої комплементарно антикодону формілметіоніл-тРНК приєднується мРНК за допомогою кодону АУГ (рис.8.26.).

С

лід вказати на особливу роль формілметіоніл-тРНК: Вона допомагає мРНК знайти на 30S субодиниці певне місце, що забезпечує точну трансляцію інформації про послідовність амінокислот у поліпептидному ланцюзі (встановлення рамки). Як тільки мРНК приєднується до комплексу, вивільняється білковий чинник 1F-3 і комплекс, що залишився, легко приєднує 50S субодиницю, утворюючи функціонально активну 70S рибосому.

У процесі цих перебудов рибосоми звільняють решту білкових чинників ініціації та продуктів гідролізу ГТФ (ГДФ і неорганічний фосфат), енергія яких витрачається, на формування 70S комплексу рибосоми. У цьому комплексі формілметіоніл-тРНК знаходиться прикріпленою до пептидилзв’язуючого центру рибосоми. У гідролізі ГТФ бере участь 1F-2. У активної 70S рибосоми, яка містить формілметіоніл-тРНК виявляється вільним аміноацильний центр, який може реагувати з певною аа-тРНК, відповідною черговому кодону мРНК. З цього моменту починається II етап синтезу білка-елонгація.

8.2.6.2. Елонгація трансляції. Процес елонгації поліпептидного ланцюга у Е. соli починається з утворення першого пептидного зв’язку і безпосередньо пов’язаний з великою субодиницею (50S) рибосоми, що містить два центри для зв’язування тРНК: один з них називається аміноацильним (А), інший-пептидильним (П) (рис. 8.27).

У процесі елонгації у Е. coli також бере участь три білкових фактори- чинники елонгації трансляції, що позначаються Тu, Ts i G (табл. 14.1): EF-Tu (М.м. 43 000 Да), EF - Ts (М.м. 35 000 Да) і EF - G (М.м. 80 000 Да). У еукаріот також відкриті три таких чинники, що позначаються відповідно еЕF-1α (М.м. 53 000 Да), еЕF-1 αβ (М.м. 30 000 Да) і еЕF-2; майже всі вони отримані в чистому вигляді, для ряду з них встановлена первинна структура.

Процес елонгації прийнято ділити на 3 стадії: розпізнавання кодону і зв’язування аміноацил-тРНК, утворення пептидного зв’язку і транслокацію. На I стадії відповідно до природи кодону мРНК у вільну А-ділянку рибосоми доставляється аміноацил-тРНК за участю чинника елонгації Tu. Цей процес вимагає затрати енергії і зв’язаний з гідролізом ГТФ і утворенням міцно зв’язаного комплексу Tu- ГТФ.

Комплекс, що утворився, піддається дисоціації тільки в присутності іншого чинника елонгації Тs, при якому Тu може знову з’єднуватися з молекулою ГТФ і брати участь у перенесенні аа-тРНК у рибосому. Таким чином, в 70S рибосомi в момент трансляції в пептидильному центрі розташовується формілметіоніл-тРНК, а в А - центрі - аміноацил-тРНК (перша амінокислота після метіоніну).

З того моменту починається II стадія елонгації - утворення першого пептидного зв’язку. Для цього в рибосомі здійснюється ферментативна реакція між формілметіоніл-тРНК в П-центрі і новою аа-тРНК в А-центрі. В процесі цієї реакції залишок формілметіоніну переноситься на вільну NH₂-групу аа-тРНК і утворюється перший пептидний зв’язок у поліпептидному ланцюзі. Одночасно з пептидильного центру звільняється тРНК^фМет у цитозоль. Фермент, що каталізує реакцію, отримав назву пептидилтрансферази (рис. 8.28.). Таким чином, у процесі транспептидазної реакції в А - центрі утворюється дипептидил-тРНК, а П-центр залишається вільним (вакантним).

Н

Рис. 8. 28. Перенесення фМет-тРНК між двома центрами (П і А) на велику 50S субодиницю рибосоми

а III стадії процесу елонгації необхідно мати вільний аміноацильний центр для приєднання наступної аа-тРНК. Для цього завдяки процесу транслокації дипептидил-тРНК, що утворився, переноситься від аміноацильного на пептидильний центр. Досягається транслокація завдяки пересуванню рибосоми відносно мРНК за участю ферменту транслокази (функцію її виконує чинник елонгації З у Е. соli і еЕF-2 у еукаріот) за рахунок використання енергії розпаду ще однієї молекули ГТФНа III стадії процесу елонгації необхідно мати вільний аміноацильний центр для приєднання наступної аа-тРНК. Для цього завдяки процесу транслокації дипептидил-тРНК, що утворився, переноситься від аміноацильного на пептидильний центр. Досягається транслокація завдяки пересуванню рибосоми відносно мРНК за участю ферменту транслокази (функцію її виконує чинник елонгації З у Е. соli і еЕF-2 у еукаріот) за рахунок використання енергії розпаду ще однієї молекули ГТФ

Урезультаті транслокації дипептидил-тРНК займає місце в пептидильному центрі рибосоми, а аміноацильний центр звільняється для нового циклу розпізнавання і може приєднати наступну аа-тРНК, відповідну кодону мРНК. У процесі транслокації рибосома переміщається вздовж мРНК у напрямку до її 3’-кінця на відстань в один кодон, тобто точно на один триплет (рис.8.29). Рибосома вступає у наступний цикл – відбувається приєднання третього амінокислотного залишку і так дальше.

Таким чином, на стадії елонгації відбувається послідовне нарощування поліпептидного ланцюга по одній амінокислоті в строгій відповідності з послідовністю триплетів (кодонів) у молекулі мРНК.

Істотним є з’ясування питання про кількість енергії, необхідної для синтезу одного пептидного зв’язку при біосинтезі білка. Як було відмічено, при активуванні амінокислоти ще до стадії ініціації, тобто при формуванні аа-тРНК, витрачається енергія розпаду АТФ на АМФ і пірофосфат, що приблизно еквівалентно гідролізу 2 молекул АТФ до 2 молекул АДФ, оскільки пірофосфат піддається розпаду на 2 молекули неорганічного фосфату.

Для включення аміноацил-тРНК в аміноацильний центр використовується енергія гідролізу молекули ГТФ на ГДФ і неорганічний фосфат. Нарешті, транслокація що транслює 70S рибосоми також потребує енергії гідролізу ще однієї молекули ГТФ. Таким чином, енергетичні потреби синтезу кожного пептидного зв’язку еквівалентні енергії гідролізу 2 молекул АТФ і 2 молекул ГТФ (тобто гідроліз чотирьох макроергічних фосфатних зв’язків) до відповідних нуклеозиддифосфатiв.

8.2.6.3. Термінацiя трансляції. На IV стадії біосинтезу білка завершується синтез поліпептидного ланцюга в 70S рибосомi за участю трьох білкових чинників термiнації (рилізінг-факторів). Ці білки позначаються RF-1 (М.м. 47 000 Да), RF -2 (М.м. 35 000-48 000 Да) і RF -3 (М.м. 46 000 Да) у прокаріот (табл. 14.1). У клітинах тварин відкритий білок з аналогічною властивістю - рилізінг-фактор R (еRF, М.м. 56 000-105 000 Да). У Е. соli RF-1, наділений властивістю розпізнавання в молекулі мРНК кодонів термінації – УАГ і УАА, а RF-2-відповідно - УГА і УАА.

Рилізінг-фактор еRF розпізнає всі три кодони термінації (нонсенс-кодони) та індукує звільнення синтезованого поліпептиду опосередковано через пептидилтрансферазу. Після того, як нонсенс-кодон мРНК займає своє місце в аміноацильному центрі рибосоми, до нього приєднується не тРНК, оскільки відсутні відповідні антикодони тРНК, що розпізнають цей термінальний сигнал, а один з білкових чинників термінації і блокується подальша елонгація ланцюга.

В

важають, що кодони термінації та білкові чинники індукують зміну специфічності пептидилтрансферазної активності таким чином, що вона каталізує перенесення пептидного ланцюга швидше до молекули води, викликаючи гідроліз, ніж до аміногрупи амінокислоти. Наслідком цього є відділення білкової молекули від рибосоми і звільнення молекул тРНК і мРНК

(остання піддається розпаду до окремих рибонуклеотидів). Одночасно 70S рибосома дисоціює на дві субодиниці – 30S і 50S, які поступають у вільний пул і можуть знов використовуватися для реасоціації нової рибосоми (рис. 8.30.). ГТФ в термінації трансляції у Е. соli розглядається як алостеричний регулятор, а у еукаріот ГТФ, імовірно, розпадається на ГДФ та Ф_н.

Узагальній формі залежність між реплікацією ДНК, транскрипцією і трансляцією мРНК представлена на рис. 8.31.

Дана мРНК транслюється не однією рибосомою, а одночасно багатьма, розташованими близько одна до одної. Подібні скупчення рибосом на мРНК отримали назву полірибосом, або полісом (рис. 8.31.). Вони значно підвищують ефективність використання мРНК, тобто прискорюють синтез білка.

Рибосоми рухаються у напрямі 5’ → 3’ уздовж ланцюга мРНК, причому кожна рибосома працює самостійно, синтезуючи окремий білок (рис. 8.32.).

Рибосома, таким чином, дозволяє забезпечити високу швидкість трансляції єдиної мРНК

8.2.7. Транспорт синтезованих білків через мембрани. Крім використання білків для потреб самої клітини, існують білки, які функціонують поза клітиною і переносяться через клітинну мембрану за допомогою особливих низькомолекулярних пептидів (від 15 до 30 амінокислотних залишків), що отримали назву лідируючих або сигнальних пептидів.

Особливість їх складу – вміст гідрофобних радикалів, що дозволяє їм легко проникати через біліпідний шар мембрани або вбудовуватися в мембрану. Ці сигнальні послідовності в рибосомах утворюються першими з N -кінця при синтезі білка за програмою сигнальних кодонів, розташованих відразу після ініціюючого кодону, і легко розпізнаються рецепторними ділянками мембрани ендоплазматичного ретикулуму. При цьому утворюється комплекс між мРНК, рибосомою і мембранними рецепторними білками, формуючи своєрідний канал в мембрані, через який сигнальний пептид проникає всередину цистерни ендоплазматичного ретикулуму, захоплюючи і протягаючи за собою молекулу білка, що синтезується.

У процесі проходження або після проникнення поліпептида в цистерни N- кінцева сигнальна послідовність відщеплюється під дією специфічної лідируючої сигнальної пептидази, а сформований білок через апарат Гольджі виходить з клітини у формі секреторної бульбашки.

8.2.8. Синтез мітохондріальних білків. У мітохондріях клітин вищих організмів міститься до 2 % клітинної ДНК, що відрізняється від ДНК ядра за масою та структурою. Мітохондрії мають весь апарат, включаючи рибосоми, тРНК і мРНК, необхідний для синтезу певних білків. Білки, що синтезуються в мітохондріях, є нерозчинними і беруть участь в основному в організації структури цієї ж органели, тоді як місцем синтезу розчинних мітохондріальних білків є рибосоми цитоплазми, звідки вони потім транспортуються в мітохондрії.

Рибосоми в мітохондріях мають менший розмір, ніж 80S рибосоми в цитоплазмі. Ініціюючою амінокислотою при синтезі білка в мітохондріях еукаріот може бути N-формілметіонін, а не вільний метіонін, як в цитоплазмі. Ця свідчить про те, що мітохондріальний синтез білка за механізмом, очевидно, близький до синтезу білка у прокарiот.

8.2.9. Посттрансляційна модифікація пептидних ланцюгів. На останній стадії синтезу білка відбуваються формування третинної структури і процесінг молекули поліпептиду. Синтезована на рибосомі в строгій відповідності з генетичною програмою лінійна одновимірна поліпептидна молекула вже містить певну інформацію. Така молекула називається конформаційною, піддається перетворенню (процесінгу) на строго певне тривимірне тіло, яке само наділене інформацією, але вже функціональною. Вказане твердження справедливе для молекул білків, що виконують в основному структурні функції, але не для біологічно неактивних молекул попередників білків, функціональна активність яких виявляється пізніше в результаті різноманітних перетворень, об’єднаних поняттям „постсинтетична або посттрансляційна модифікація”. Подібні модифікації структури поліпептиду починаються або відразу після трансляції, або ще до закінчення формування третинної структури білкової молекули.

Крім вказаного процесу протеолітичного видалення сигнального пептиду, в багатьох білках відщеплюється початковий N-кінцевий метіонін. Виявилось, що в клітинах прокаріот є особливі ферменти, які модифікують N-кінцеві залишки, зокрема деформілаза, що каталізує відщеплення формильної групи від N-кінцевого метіоніну, а також амінопептидаза, що каталізує відщеплення не тільки N-кінцевого формілметіоніну (або метіоніну в еукаріот), але, можливо, і інших залишків амінокислот з N - кінця пептиду.

Аналогічно так званому обмеженому постасинтетичному протеолізу піддаються деякі пробілки, або проферменти (наприклад, трипсиноген, хімотрипсиноген і ін.) та попередники гормонів (наприклад, препроінсулін, пре-β-ліпотропін і ін.). У ряді випадків спостерігається і С-кінцева модифікація синтезованого білка.

Як відомо, ділянка ДНК, що несе інформацію про синтез індивідуального білка, називається геном, а ділянка, яка контролює синтез поліпептидного ланцюга і відповідальна за нього, - цистроном. Отже, якщо білок складається з декількох поліпептидів, то природно припустити, що в синтезі такого білка повинні брати участь декілька (більше, ніж один) цистронів. Це не завжди відповідає дійсності, особливо якщо поліпептидні ланцюги ідентичні (наприклад, α₂- і β₂ - ланцюги гемоглобіну). Якщо, наприклад, пептидні ланцюги якої-небудь однієї білкової молекули є неідентичними, то це не завжди означає, що вони синтезуються як результат дії різних цистронів.

Подібний білок може синтезуватися у вигляді єдиного поліпептидного ланцюга з подальшими протеолітичними розривами в одному або декількох місцях і відщепленням неактивних ділянок. Типовим прикладом подібної модифікації є гормон інсулін, що синтезується у вигляді єдиного поліпептиду - препроінсуліну, який після ферментативного гідролізу перетворюється спочатку на неактивний попередник проінсулін, а потім в активний гормон інсулін, що містить два різних за розміром і послідовністю поліпептидні ланцюги.

Слід підкреслити, що важливе значення має посттрансляційна хімічна модифікація білків, яка впливає на радикали окремих амінокислот. Однією з таких істотних модифікацій є ковалентне приєднання простетичної групи до молекули білка. Наприклад, тільки після приєднання піридоксальфосфату до ε-аміногрупи залишку лізину білкової частини – апоферменту - утворюється біологічно активна тривимірна конфігурація амінотрансфераз, які каталізують реакції трансамінування амінокислот. Деякі білки піддаються глікозилюванню, приєднують олігосахаридні залишки (утворення глікопротеїнів) і забезпечують тим самим поступлення білків у клітини-мішені.

Широко представлені хімічні модифікації білків у результаті реакції гідроксилювання залишків проліну, лізину (при формуванні молекул колагену), реакції метилювання (залишки лізину, глутамату), ацетилювання ряду N-кінцевих амінокислот, реакції карбоксилювання залишків глутамату і аспартату ряду білків. Зокрема, протромбін (білок згортальної системи крові) містить ряд γ-карбоксиглутаматних залишків на N-кінці, в утворенні яких активну участь бере вітамін К. Припускають, що γ -карбоксиглутаматні залишки беруть участь у зв’язуванні іонів Са²⁺, необхідних для ініціації згортання крові.

Однією з поширених хімічних постсинтетичних модифікацій є фосфорилювання залишків серину і треоніну, наприклад, в молекулі гістонових і негістонових білків, а також казеїну молока. Фосфорилювання-дефосфорилювання ОН-групи серину необхідне для функціонування безлічі ферментів, наприклад для активності глікогенфосфорилази і глікогенсинтази.

Фосфорилювання деяких залишків тирозину в молекулі білка в даний час розглядається як один з можливих і специфічних етапів формування онкобілків при малігнізації нормальних клітин. Добре відомі також реакції окиснення двох залишків цистеїну і утворення внутрішьо- і межланцюгових дисульфідних зв’язків при формуванні третинної структури (фолдінг). Цим забезпечується не тільки захист від зовнішніх денатуруючих агентів, але і утворення нативної конформації і прояв біологічної активності.

Менш відомі реакції фарнезилювання залишків цистеїну ряду білків: білка G, групи білків ядерного матриксу, а також білків-онкогенів rаs і протоонкогенів; джерелом ізопренових груп є фарнезилпірофосфат (проміжний продукт при синтезі холестерину). Отримані докази, що блокування реакції фарнезилювання, викликане специфічними препаратами (інгібіторами), призводить до втрати канцерогенної активності онкогенна rаs. Ці результати можуть служити основою для розробки ефективних засобів боротьби з пухлинними захворюваннями людини, основані на інгібуванні посттрансляційної модифікації білків взагалі або онкобілків зокрема.

Модифікація N- і С – кінця білків. У прокаріот всі поліпептидні ланцюги починаються із залишку N-формілметіоніну, а в еукаріот – із залишку метіоніну. Однак формильна група, ініціюючий метіонін, інколи декілька наступних за ними амінокислотних залишків видаляються за допомогою особливих ферментів.

У деяких білках після трансляції ацетилюється аміногрупа N-кінцевого залишку, а в інших - модифікації підлягає С- кінцевий залишок.

Приєднання бічних вуглеводних ланцюгів. Бічні вуглеводні ланцюги глікопротеїнів ковалентно приєднуються до білка під час або після синтезу останнього. В одних глікопротеїнах бічні вуглеводні ланцюги приєднуються за допомогою залишків аспарагінової кислоти, а в інших - серину або треоніну.

Видалення сигнальних послідовностей. Деякі білки містять на N- кінці додаткову поліпептидну послідовність із 15 – 30 залишків амінокислот, яка направляє цей білок до місця його призначення в клітині. Такі сигнальні послідовності усуваються за допомогою пептидаз.

Утворення дисульфідних мостиків. У багатьох білках в процесі формування їх нативної конформації появляються поперечні зшивки у результаті ферментативного утворення дисульфідних мостиків між залишками цистеїну, що захищає молекулу білка від денатурації.

Слід зазначити, хоч біосинтез білка детально описаний у багатьох оглядах і монографіях, однак знання про структурно-функціональні особливості багатьох його етапів ще недостатні. Наприклад, недостатньо відомо, які ділянки або складові частини рибосом відповідальні за ініціацію, елонгацію і термінацію білкового синтезу; який молекулярний механізм процесів транслокації, пептидилтрансферазної реакції; які тонкі взаємодії рибосом з білковими чинниками, мРНК, тРНК і антибіотиками.

8.2.10. Позарибосомний механізм синтезу пептидів. Відомо, що в основі біосинтезу майже всіх білків живих організмів лежить матричний механізм синтезу. Проте синтез ряду низькомолекулярних (коротких) пептидів у біологічних системах може здійснюватися не тільки без участі нуклеїнових кислот, зокрема без мРНК, але навіть у відсутності рибосом. Ще на X Міжнародному біохімічному конгресі в Гамбурзі в 1976 р. Ф. Ліпман (США) і К. Курахаси (Японія) представили експериментальні докази синтезу двох природних циклічних пептидних антиботиків – граміцидину S і тироцидину як в цілісних екстрактах, отриманих із Bacillus brevis, так і в ізольованих з екстрактів білкових фракціях. Зокрема, виділені з екстрактів B. brevis і очищені два білкові препарати забезпечували точність збірки циклічного поліпептиду-граміцидину S, що складається з 10 амінокислотних залишків, розташованих у певній послідовності. Очищені білкові фракції (М.м. 100 000 і 180 000) вимагала присутності тільки вільних амінокислот, АТФ і іонів Мg²⁺ для синтезу цього циклічного декапептиду.

Показано, що саме легка білкова фракція (М.м. 100 000) забезпечує рацемізування і включення D-фенілаланіну в перший поліпептидний ланцюг, а важка фракція (М.м. 180 000) – включення решти 4 L-амінокислот; обидва ферменти беруть участь також і в утворенні пептидних зв’язків. Аналогічно синтезується такий же пентапептид на розташованому поряд мультиферментному комплексі, потім обидва пентапептиди з’єднуються за типом „голова” до „хвоста” із замиканням ланцюга і утворенням циклічного декапептиду.

У механізмі синтезу передбачається попереднє утворення аміноациладенілатів (за участю цих же ферментів), з яких залишки амінокислот потім переносяться на SН-групи обох ферментів. При цьому утворюються активовані проміжні тіоефіри, подібні до тіоефірів при синтезі вищих жирних кислот. У структурі першого (легкого) ферменту відкритий ковалентний зв’язаний залишок фосфопантотеїну, тому припускають участь його тіолової групи в перенесенні пептидного ланцюга з однієї ділянки ферменту на іншу. Аналогічний механізм синтезу доведений також для антибіотика тироцидину (декапептид) і для 13-членного циклічного пептиду - антибіотика мікобациліну.

Таким чином, природа, очевидно, не втратила атавістичного механізму синтезу білкових молекул і користується для цього примітивними, але достатньо ефективними прийомами.

8.2.11.Регуляція трансляції. Рибосомальний синтез поліпептидногого становить кінцевий етап багатоспупеневого процесу генної експресії і контролюється регуляторними системами клітини та впливом різних фізіологічно активних сполук.

Молекулярним механізмом контролю трансляції у клітинах еукаріот виступає ковалентна модифікація білкового фактора ініціації трансляції еIF-2, який може бути у фосфорильованій (неактивній) та дефосфорильованій (активній) формі.

Прикладом такої регуляції трансляції шляхом зворотного фосфорилювання – дефосфорилювання фактора ініціації еIF-2 за участю цАМФ – залежного регуляторного каскаду відбувається контроль синтезу глобіну – білкової частини гемоглобіну в залежності від поступлення відповідно гему.

Процес здійснюється наступним чином: внаслідок фосфорилювання α- субодиниці фактора ініціації синтезу глобіну еIF-2 під дією специфічної еIF-2 –протеїнкінази відбувається інактивування фактора і блокується процес ініціації трансляції. Активність еIF-2 –кінази, що фосфорилює фактор еIF-2, контролюється також іншою цАМФ – залежною протеїнкіназою. Каталітична активність цАМФ – залежної протеїнкінази контролюється гемом, який виступає її інгібітором. При високій концентрації гему активність протеїнкінази, яка фосфорилює фактор еIF-2, блокується , а це призводить до утворення дефосфорильованої форми тобто активної форми фактора ініціації і, відповідно, синтезу глобіну. При вичерпанні резерву гему система синтезу глобіну переходить у неактивний стан і утворення гемоглобіну гальмується.

8.2.12. Інгібітори транскрипції та трансляції у прокаріотів та еукаріотів. Інгібітори трансляції. Один з шляхів з’ясування тонких молекулярних механізмів синтезу нуклеїнових кислот і білків в клітинах - використання таких лікарських препаратів, які могли б вибірково гальмувати ці процеси у бактерій, але не впливати на клітини організму людини. Деякі препарати, дійсно, мають таку вибіркову дію, взаємодіють з білками рибосом прокаріот і вимикають бактерійний синтез білка. Проте багато з них є токсичними і для людини.Припинення матричного біосинтезу призводить до загибелі клітин.

Всі речовини, що блокують синтез білків, можна розділити на інгібітори: а) транскрипції; б) процесінгу і транспорту РНК; в) трансляції.

І н г і б і т о р и т р а н с к р и п ц і ї за механізмом дії ділять на три групи: інгібітори ДНК – залежних РНК – полімераз, які блокують ДНК - матрицю і спотворюють інформацію для синтезу РНК. Як приклад препаратів, що відносять до першої групи можна назвати: α – аманітин (отрута блідої поганки), вибірково інгібує РНК – полімеразу ІІІ (відповідає за транскрипцію мРНК); антибіотики рифаміциниЮ які блокують ядерцеву РНК – полімеразу І (відповідає за транскрипцію рРНК) і зворотну траскриптазу.

До другої групи відносять речовини, які зв’язуються нековалентно з матрицею ДНК і гальмують дію РНК полімерази. Наприклад, актиноміцин D, а також антибіотики олівоміцин, актиноміцин і рослинні алкалоїди – вінбластин, вінкристин, які застосовують у медицині як протипухлинні засоби.

До третьої групи можна віднести, наприклад, 5 – фторурацил, який включається в мРНК замість природного нуклеотиду.

І н г і б і т о р и п р о ц е с і н г у і т р а н с п о р т у мРНК. Інгібіторами синтезу білка на цьому етапі можуть бути інгібітори внутрішньоядерних РНКаз, РНК – лігаз, які каталізують різні фази дозрівання мРНК. Перешкоджає приєднанню поліаденілового фрагменту до мРНК кордіцепін (3 - дезоксіаденозин), який називають інгібітором транспорту мРНК, оскільки цей поліаденіловий фрагмент полегшує її транспорт із ядра в цитоплазму.

І г і б і т о р и т р а н с л я ц і ї (синтезу білка в рибосомах) у прокаріотичних та еукаріотичних клітинах діють на різних її етапах:

1. Інгібітори ініціації: стрептоміцин, ауринтрикарбоксилова кислота.

2. Інгібітори елонгації: аміцетин, хлорамфенікол (левоміцетин), еритроміцин, циклогексимід, пуроміцин, тетрацикліни.

3. Інгібітори термінації: анізоміцин, хлорамфенікол, еритроміцин, лінкоцин, стрептоміцин.

Антибіотики, що є інгібіторами процесів трансляції у прокаріотів, застосовують як антибактеріальні лікарські засоби при інфекційних хворобах та захворюваннях, викликаних мікроорганізмами.

Антибіотики, які інгібують трансляцію в еукаріотичних клітинах вищих організмів, застосовують як протипухлинні засоби.

За рахунок впливу на процес ініціації трансляції в еукаріотів реалізуються захисні ефекти інтерферонів – білків, які регулюють деякі функції клітини, зокрема, реакцію клітини на вірусну інфекцію. В організмі людини відомо біля біля десяти споріднених, але дещо відмінних за структурою та властивостями інтерферонів. Синтез інтерферонів індукується деякими компонентами вірусних частинок., в тому ислі двох спіральною РНК, яка є наявна в багатьох вірусах.

Інтерферон, в свою чергу, індукує синтез ферменту протеїнкінази, яка каталізує фосфорилювання одного з факторів ініціації – фактора elF-2, який може бути в дефосфорильованій формі (активній) та фосфорильованій (неактивній) формах.

elF-2 +АТФ →elF-2-ОРО₃Н₂+ АДФ

Унаслідок цієї реакції фактор ініціації втрачає активність і синтез білків у клітині припиняється. Крім цього, в результаті складної послідовностіі реакцій інтерферони активують латентну РНКазу, яка розщеплює мРНК і рРНК. У результаті вказаного спричиняється загибель клітини мікроорганізму, і тим самим запобігається розмноження часточок віріонів.

Крім антивірусної дії, деякі інтерферони гальмують розмноження клітин злоякісних пухлин, тому розглядаються як перспективні антипухлинні засоби.

Одним з сильних інгібіторів білкового синтезу є пуроміцин. За будовою є аналогом кінцевої ділянки аміноацил-тРНК аденілової кислоти і тому легко взаємодіє з А-центром пептидил-тРНК з утворенням пептидил-пуроміцину. Пептидил-пуроміцин не містить триплету антикодону і тому гальмує елонгацію пептидного ланцюга, викликає гальмування реакції, тобто передчасну термінацію синтезу білка. Пуроміцин має гальмівну дію на синтез білка як у прокаріот, так і в еукаріот.

Б

ілковий синтез гальмується актиноміциномD, що має протипухлинний ефект, проте внаслідок високої токсичності препарат застосовується рідко. Він гальмує синтез всіх типів клітинної РНК, особливо мРНК. Дана властивість пояснюється гальмівним впливом актиноміцину D на ДНК- залежну - РНК - полімеразу, оскільки він зв’язується із залишками дезоксигуанозину ланцюга ДНК і вимикає матричну функцію останньої. Це дає підставу вважати, що актиноміцин D інгібує транскрипцію ДНК.

Іншим антибіотиком, що також гальмує синтез клітинної РНК, є рифаміцин, який використовується при лікуванні туберкульозу. Цей препарат гальмує активність ДНК-залежної - РНК - полімерази. Найбільш чутливою до нього виявилася РНК-полімераза бактерій. На організм тварин цей антибіотик проявляє незначний вплив. За механізмом дії він відрізняється від актиноміцинуD. Крім цього, відкрито противірусну дію рифаміцину; зокрема, він успішно використовується при лікуванні трахоми, яка викликається ДНК-вмісним вірусом. Це дає основу припустити, що даний антибіотик знайде застосування в клінічній онкології при лікуванні пухлин, які викликаються вірусами.

Одним із сильних інгібіторів синтезу вірусної РНК виявився азидотимідин. Було показано, що вірус імунодефіциту людини містить рибонуклеїновий геном, у складі якого є як стандартні гени ретровірусів, так і незвичайні невеликі гени з рядом функцій. Останні, зокрема, схильні до мутацій з високою швидкістю внаслідок низької точності реплікації, викликаної властивостями зворотної транскриптази. Ця вірусна зворотна транскриптаза імунодефіциту людини проявляє значно більшу спорідненість до азидотимідину, ніж до природного дезокситимідинтрифосфату (дТТФ). Азидотимідин конкурентно гальмує зв’язування дТТФ, викликає тим самим термінацію (закінчення) синтезу вірусної РНК.

З’ясовані деякі деталі механізму дії ряду інших антибіотиків, що використовуються при лікуванні тифозних інфекцій. Так, хлорамфенікол інгібірує пептидилтрансферазну реакцію (на стадії елонгації) синтезу білка в 70S рибосомі бактерій; на цей процес в 80S рибосомi він не діє. Гальмує синтез білка в 80S рибосомi (без порушення процесу в 70S рибосомi) циклогексимiд-специфічний інгібітор транслокази.

Цікавий молекулярний механізм дії дифтерійного токсину, що виробляється клітинами Corinebacterium diphteriae. Розмножується у поверхневому шарі слизової зіва й суміжних ділянок і спричинює небезпечну хворобу дітей та дорослих. Дифтерійний токсин – білок, побудований з одного поліпептидного ланцюга, з М.м. 61 000 Да, в організмі людини розщеплюється на два фрагменти: активний А- фрагмент (М.м. 21 000 Да) і неактивний В – фрагмент (М.м. 40 000 Да).

А – фрагмент є ферментом АДФ – рибозилтрансферазою, проявляє здатність каталізувати реакцію АДФ-рибозилювання чинника елонгації еукаріот (еЕF-2), за рахунок перенесення АДФ – рибозильного залишка з НАД на фактор елонгації еЕF-2, вимикає тим самим його участь у синтезі білка.

НАД + еЕF-2 → АДФ – рибозил - ЕF-2 + Нікотинамід + Н⁺

Модифікований таким чином фактор елонгації втрачає свою здатність приймати участь у транслокації рибосоми і трансляція припиняється. Цим і пояснюється токсичність дії дифтерійного токсину. Фрагмент В не має ферментативної активності і не токсичний, але необхідний для проникнення фрагменту В всередину клітини.

Резистентність багатьох тварин до дифтерійного токсину, найімовірніше, обумовлена утрудненням або повною відсутністю проникнення (транспорту) токсину через мембрану клітин.

Протитуберкульозні та антибактеріальні антибіотики, зокрема стрептоміцин і неоміцин, діють на білоксинтезуючий апарат чутливих до них штамів бактерій. Було висловлено припущення, що ці антибіотики обумовлюють помилки в трансляції мРНК, що призводять до порушення, між кодонами і амінокислотами, що включаються у синтез білка: наприклад, кодон УУУ замість фенілаланіну починає кодувати лейцин, внаслідок чого утворюється аномальний білок, що призводить до загибелі бактерій.

Стрептоміцин впливає на 70S рибосоми бактерій і не діє на 80S рибосоми. Специфічно зв’язується з білком малої субодиниціі порушує правильне зчитування мРНК. Синтез білка при цьому припиняється або утворюється дефектний білок, не здатний функціонувати.

Тетрациклін також виявився інгібітором синтезу білка в 70S рибосомi (менше гальмується синтез в 80S рибосомi). Вони легко проникають через клітинну мембрану. Вважають, що тетрациклін гальмує зв’язування аміноацил-тРНК з аміноацильним центром у 50S рибосомі. Можливо, що тетрациклін хімічно зв’язується з цим центром і вимикає тим самим одну з важливих стадій процесу трансляції.

Пеніциліни не є істинними інгібіторами синтезу білка, проте їх антибактеріальний ефект пов’язаний з гальмуванням синтезу гексапептидів, що входять до складу клітинної стінки. Механізм їх синтезу відрізняється від механізму синтезу білка в рибосомах.

Еритроміцин і олеандоміцин гальмують активність транслокази в процесі трансляції, подібно циклогексиміду, виключно в 80S рибосомах, тобто гальмують синтез білка в клітинах тварин.

Отримані дані про механізм дії антибіотиків на синтез білка з урахуванням стадії і топографії процесу трансляції представлені в табл. 8.2 (За Харпером з невеликими змінами).

Слід ще раз підкреслити, що порушення або випадання будь-якої ланки, що бере участь у синтезі білка, майже завжди призводить до розвитку патології, причому клінічні прояви захворювання визначатимуться природою і функцією білка, синтез якого виявляється порушеним (структурний або функціональний білок). Іноді синтезуються так звані аномальні білки, як результат дії мутагенних чинників і відповідно зміни генетичного коду (наприклад, гемоглобін при серпоподібноклітинній анемії). Наслідки цих порушень можуть проявлятися у розвитку найрізноманітніших синдромів або закінчуватися летально.

Таблиця 8. 2. Антибіотики - інгібітори трансляції

Стадія трансляції	Еукаріоти		Прокаріоти
	цитоплазма	мітохондрія
1. Ініціація Ауринтрикарбонована кислота 2. Елонгація Амецетин Анізоміцин Лінкоміцин Неоміцин Пуроміцин Спарсоміцин Тетрацикліни Фузидова кислота Хлорамфенікол (левоміцетин) Циклогексимид 3. Термінація Аміцетин Анізоміцин Лінкоміцин Спарсоміцин Стрептоміцин Хлорамфенікол (левоміцетин) Еритроміцин	- ? - - + + + - ? - + ? ? ? + + - -	- ? ? ? + + + + ? + - ? ? ? + + - +	+ + + + + + + + + + - + * + + + + +

_{Умовні позначення: + гальмування; - відсутність гальмування; * стимулювання; ?- невідомо.}

Необхідно зазначити, що організм має потужні механізми захисту. Подібні зміни генетичного апарату швидко розпізнаються специфічними ферментами - рестриктазами, змінені послідовності вирізаються і знову замінюються відповідними нуклеотидами за участю полімераз та лігаз.

Індуктори трансляції. Препарати цієї групи виступають індукторами біосинтезу білків і відносяться до так званих анаболічних засобів. Останні бувають гормональними і негормональними засобами.

Найбільш поширена група препаратів гормональної природи. Серед них найбільш вираженою здатністю до індукції синтезу білків (діє на рівні транскрипції) мають анаболічні стероїди (метандростенолон, феноболін і найактивніший ретаболіл), які є похідними чоловічих статевих гормонів (андрогенів) і застосовуються з метою стимуляції синтезу білків в організмі.

Виражену анаболічну активність виявляє інсулін, цей гормон активує синтез білка на рівні трансляції.

До негормональних анаболічних засобів відносяться попередники нуклеотидів і нуклеїнових кислот. Наприклад, оротат калію (оротова кислота є ключовою речовиною в біосинтезі піримідинових нуклеотидів), інозит (або гіпоксантинрибозид). Механізм анаболічної дії, очевидно, пов’язаний не тільки з використанням їх як структурного матеріалу для синтезу нуклеїнових кислот, але головним чином з тим, що вони, або продукти їх метаболізму служать індукторами синтезу білків.