4.1. Изучение влияния лигноцеллюлозных субстратов на синтез основного фермента-биокатализатора деструкции

С целью изучения влияния лигноцеллюлозных субстратов на синтез основного фермента-биокатализатора деструкции был проведен эксперимент в условиях глубинного культивирования на качалке.

В качестве лигноцеллюлозных индукторов в опыте сравнивали:

- дубовые опилки;

- березовые опилки;

- сосновые опилки;

- костру льна;

- подсолнечную лузгу.

В качестве контрольной среды использовали питательную среду следующего состава (г/л): мука пшеничная – 29,0 г/л; аммоний азотнокислый – 2,0 г/л; калий фосфорнокислый однозамещенный – 1,3 г/л; кукурузный экстракт сгущенный – 6,4 г/л; сульфат меди – 0,5 г/л; вода водопроводная – до 1 л; рН до стерилизации 5,65-5,85.

Индукторы предварительно стерилизовали в сухом виде в пробирках в автоклаве под давлением 1 ати в течение 60 мин и повторно через сутки при том же режиме. Индукторы вносили в колбы со стерильной средой при засеве в количестве 2 г/л.

Культуру гриба Trametes hirsutа 56 выращивали методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с объемом среды 150 мл на круговой качалке при 200 об/мин и температуре 30-32 ⁰С. Среду инокулировали мицелиальной взвесью в количестве 10 % по объему с определением концентрации биомассы в среде после засева в пересчете на абсолютно сухую массу.

Оксидазную активность изучали в динамике, пробы из каждого варианта среды отбирали в четырех повторностях на 3, 4, 5, 6, 7 и 10 сутки опыта.

Результаты опыта приведены на Рисунок 1.

Из графика видно, что все индукторы приводили к повышению оксидазной активности, но наибольшая активность фермента зафиксирована при использовании дубовых опилок (9,7 Е_ОА) уже на 4 сутки культивирования.

Оксидазная активность в этом случае была на 33% выше активности среды с сосновыми опилками (8 Е_ОАна 5 сутки), на 31% выше активности среды с березовыми опилками (7,6 Е_ОАна 4 сутки), на 56% (7,1 Е_ОАна 5 сутки) - среды с подсолнечной лузгой и на 65% (6,7 Е_ОАна сутки) - среды с кострой льна.

Активность при использовании дубовых опилок выше активности в контрольной среде (5,5 ЕОА на 7 сутки) в 1,8 раз.

Рисунок 1. Динамика оксидазной активности в культуральной средеT.hirsutа 56 в зависимости от типа используемого индуктора

Таким образом, в результате проведенного эксперимента было показано, что лигноцеллюлозные отходы при введении их в состав питательной среды не только не снижают, но и существенно увеличивают (в 1,3-1,8 раза) синтез лакказы штаммом-продуцентом, что свидетельствует о том, что такие отходы могут быть использованы в качестве носителя для иммобилизации мицелия штамма-продуцента. Наиболее эффективны дубовые опилки, однако и такой распространенный сельскохозяйственный отход как подсолнечная лузга и костра льна отказывают положительное воздействие на синтез лакказы.

4.2. Изучение эффективности способов иммобилизации мицелия штамма-деструктора на носителях разных типов

4.2.1 Иммобилизация мицелия гриба в колбах на круговой качалке

Для проведения экспериментов по иммобилизации были выбраны субстраты, которые по литературным данным являются лучшими носителями:

• губки из нержавеющей стали [RodríguezCoutoS.etal., 2004],

• растительная губка люфа [IqbalM.etal., 2005].

Кроме того, для испытаний в качестве носителя для иммобилизации мицелия были выбраны следующие лигноцеллюлозные материалы:

• дубовые опилки, как показавшие наибольшую способность интенсифицировать синтез лакказы;

• сосновые стружки, как доступный отход деревоперерабатывающей промышленности;

• костра льна, как доступный отход льноперерабатывающей промышленности.

Губки из нержавеющей стали были порезаны на кусочки диаметром приблизительно 1,5 см. Перед использованием носитель был подвержен кипячению в течение 10 мин, а затем трижды промыт дистиллированной водой.

Люфа была порезана на диски диаметром 2,5 см и толщиной 2-3 мм. Перед использованием носитель был подвержен кипячению в течение 30 мин, а затем трижды промыт водой.

Остальные носители (дубовые опилки, сосновые стружки, костра льна) использовали в исходном виде, без дополнительной обработки.

Все выбранные носители были подвержены стерилизации в автоклаве при температуре 121 ºС в течение 20 мин.

Поскольку целью исследования было получение исходных данных и разработка экспериментальной установки для биодеградации ксенобиотиков, одной из важнейших характеристик которой является объем, носители испытывали в эквивалентных по объему, а не по площади поверхности количествах.

Для проведения иммобилизации была использована методика, предложенная

Iqbalcсоавторами [IqbalM.etal., 2005 ].

Иммобилизацию продуцента осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750мл на круговой качалке. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 150 мл питательной среды, 0,5% по объему посевного материала (IIпассаж, 3 суток роста) и носители в количестве 50 см³, что составляло для дубовых опилок – 2 г, костры льна – 2 г, стальных губок – 6 г, люфы – 3 г, сосновые стружек – 3 г (удельная площадь поверхности составила 96,8 см²/г ). В контрольные колбы вносили 150 мл питательной среды и 0,5% по объему посевного материала (IIпассаж, 3 суток роста). Активность посевного материала составила 6,2 Е_ОА.

Питательная среда имела следующий состав: мука пшеничная – 29,0 г/л; кукурузный экстракт – 6,4 г/л; NH₄NO₃– 2,0 г/л; КН₂РО₄– 1,3 г/л; вода водопроводная – до 1 л. Для стимулирования продуцирования лакказы в среду был добавленCuSO₄ в концентрации 0,05г/л.pHсреды до стерилизации – 5,6-5,8.

Затем колбы инкубировали на круговой качалке с частотой вращения 200 об/мин при температуре 32 ºС в течение 10 суток. Опыт осуществляли в трех повторностях.

Эффективность иммобилизации оценивали по отсутствию биомассы гриба в культуральной жидкости.

В результате проведения экспериментов по иммобилизации было установлено, что наилучшим образом иммобилизация мицелия гриба Trametes hirsuta 56качалочным способом происходит на стальных губках и растительной губке люфа Error: Reference source not found.

а) Рисунок 2. Иммобилизация биомассы гриба на различных носителях: а – на растительной губке люфе; б – на стальных губках

б)

Стальных губки и растительная губка люфа устойчивы к механическим и химическим воздействиям, изменениям температуры и pHсреды, но определяющим, по-видимому, является то, что их структура обеспечивает свободный доступ водной среды к иммобилизованным клеткам гриба.

Использование дубовых опилок и костры льна в качестве носителей при иммобилизации мицелия гриба качалочным способом оказалось неэффективным, о чем свидетельствовало наличие биомассы гриба в культуральной жидкости Рисунок 3, что, по-видимому, связано с отсутствием объемной структуры у этих субстратов.

а)б)

Рисунок 3. Иммобилизация биомассы гриба на: а) дубовых опилках, б) костре льна

В колбах с сосновыми стружками образовался плотный комок из стружек и иммобилизованного мицелия грибной культуры. В культуральной жидкости биомассы гриба не наблюдалось, что свидетельствует о том, что сосновые стружки являются хорошим носителем для иммобилизации, но способ иммобилизации на качалке для них не подходит Рисунок 4.

Рисунок 4. Иммобилизация биомассы гриба на сосновых стружках