4.5. Выбор модельного соединения для проведения экспериментов по биодеградации
Для проведения экспериментов по утилизации токсических веществ в промышленных стоках был осуществлен выбор модельного соединения. В качестве промышленных стоков были выбраны стоки текстильных предприятий, а в качестве модельных соединений – красителиMethylOrangeиMethylGreen.
КрасительMethylOrangeотносится к классу азокрасителей Рисунок 10, которые применяются для крашения тканей, кожи, бумаги, резины, пластмассы, а также в лакокрасочной, полиграфической и других отраслях [Химия: Энциклопедия / Под ред. И. Л. Кнунянц, 2003].
Рисунок 10. Структурная формулаMethylOrange
Краситель MethylGreenотносится к классу триарилметановых красителей Рисунок 11. Данный класс красителей применяется для окраски бумаги, кожи, пластических масс, изготовления чернил, полиграфических и штемпельных красок.
Рисунок 11. Структурная формулаMethylGreen
Известно, что MethylOrangeподвергается биодеградации лакказой с активностью 20 ЕОА(активность определяли поABTSв 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5) при 30 ºС в присутствии редокс-медиатораHBTв течение 6 часов при исходной концентрации красителя 0,02 %, а красительMethylGreen– также в течение 6 часов без применения редокс-медиаторов. [KunamneniA.etal., 2008].
4.6. Изучение влияния различных параметров на проведение процесса биодеградации модельного соединения
4.6.1. Изучение влияния концентрации модельного соединения на жизнеспособность продуцента
Для проведения эксперимента были выбраны следующие исходные концентрации красителя MethylOrange: 0,01 мг/мл, 0,05 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,5 мг/мл и 1 мг/мл.
Процесс осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в течение суток на круговой качалке при температуре 32ºС. В колбы вносили 10 мл посевного материала IIIпассажа (3 суток роста), 140 мл 0,1М раствора цитрат-фосфатного буфера (рН 4,5) и соответствующее количество красителяMethylOrangeдля достижения заданных концентраций. Общий объем раствора в каждой колбе составил 150 мл. В контрольные колбы вносили посевной материал и 0,1М раствор цитрат-фосфатного буфера в заданных соотношениях.
Через сутки после начала эксперимента из каждой колбы был сделан высев на чашки Петри с агаризованным суслом в количестве 1 мл раствора, содержащего биомассу гриба. Осмотр чашек Петри производили через трое суток после высева. Результаты проведения эксперимента представлены на Рисунок 12.
а)
б)
в)
г)
д)
е)
Рисунок 12. Высев на чашки Петри из колб, содержащих раствор с концентрацией красителя: а) контроль, б) 0,01 мг/мл, в) 0,05 мг/мл, г) 0,1 мг/мл, д) 0,5 мг/мл, е) 1 мг/мл.
В результате проведения эксперимента было установлено, что предельная концентрация модельного соединения для данного штамма находится в диапазоне 0,1 – 0,5 мг/мл. Для уточнения предельного значения концентрации модельного соединения был проведен дополнительный эксперимент.
Для проведения эксперимента были выбраны следующие исходные концентрации модельного соединения: 0,15 мг/мл, 0,2 мг/мл, 0,25 мг/мл, 0,3 мг/мл, 0,35 мг/мл, 0,4 мг/мл и 0,45 мг/мл.
Процесс осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в течение суток на круговой качалке при температуре 32ºС. В колбы вносили 10 мл посевного материала IIIпассажа (3 суток роста), 140 мл 0,1М раствора цитрат-фосфатного буфера (рН 4,5) и соответствующее количество красителяMethylOrangeдля достижения заданных концентраций. Общий объем раствора в каждой колбе составил 150 мл. В контрольные колбы вносили посевной материал и 0,1М раствор цитрат-фосфатного буфера в заданных соотношениях.
Через сутки после начала эксперимента из каждой колбы был сделан высев на чашки Петри с агаризованным суслом в количестве 1 мл раствора, содержащего биомассу гриба. Осмотр чашек Петри производили через трое суток после высева. Результаты проведения эксперимента представлены на Рисунок 13.
а)
б)
в)
г)
д)
е)
ж)
з)
Рисунок 13. Высев на чашки Петри из колб, содержащих раствор с концентрацией красителя: а) 0,15 мг/мл, б) 0,2 мг/мл, в) 0,25 мг/мл, г) 0,3 мг/мл, д) 0,35 мг/мл, е) 0,4 мг/мл, ж) 0,45 мг/мл з) контроль
При концентрации красителя 0,15 мг/мл и 0,2 мг/мл площадь обрастания мицелием гриба на третьи сутки роста составила около 80%, при концентрации модельного соединения 0,25 мг/мл – 50%, при 0,3 мг/мл – 45%, при 0,35 мг/мл – 25%. При концентрации красителя 0,4 мг/мл рост культуры на поверхности агаризованного сусла отмечен не был. При концентрации 0,45мг/мл площадь обрастания мицелием гриба на третьи сутки роста составила около 20%.
Таким образом, в результате проведения эксперимента установлено, что концентрация красителя 0,5 мг/мл и выше является летальной для клеток продуцента. Жизнеспособного мицелия в этом случае через 1 сутки экспозиции не остается. При концентрации менее 0,1 мг/мл жизнеспособность клеток продуцента сохраняется полностью. В диапазоне концентраций 0,15-0,45 мг/мл происходит постепенное снижение жизнеспособности мицелия.
На основании полученных результатов была выбрана рабочая концентрация красителя, которая составила 0,15 мг/мл. Данное значение концентрации модельного соединения соответствует значениям, приведенным в литературных источниках [RodríguezCoutoS.etal., 2004].