Глава 2.Материалы и методы исследования

2.1 Реагенты и приборы

В работе были использованы соли, химические реагенты, ингибиторы протеиназ, белковые субстраты, маркеры молекулярных масс, очищенный кальпаин 1 человека, красители, 17β-эстрадиол, L-глутаминовая кислота, нифедипин («Sigma-Aldrich», США), компоненты для вестерн-блот анализа («Bio-Rad», США), поликлональные антитела к кальпастатину sc-20779 и конъюгированные с пероксидазой антитела к IgG кролика sc-2004 («Santa Cruz Biotechnology», США). Предподготовка пептида Aβ1-40 («Sigma-Aldrich», США) включала его растворение в стерильном 0.9% NaCl до конечной концентрации 2.5 г/л и инкубацию раствора при 37 °С в течение недели для агрегации пептида.

В работе были использованы приборы: микроцентрифуга 5417R («Eppendorf», Германия), ультрацентрифуга Optima Beckman LE 80 («Beckman-Coulter», США), твердотельный термостат CH-100 («BioSan», Латвия), камера для электрофореза Mini Protean-3 Cell, камера для блот-переноса Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell, система гель-документирования Gel Doc XR Plus («Bio-Rad», США), спектрофотометр СФ-2000 (ЗАО «ОКБ-Спектр», Россия).

2.2 Моделирование нейродегенерации у лабораторных животных

Исследование проведено на одно- (серии эксперимента I и II) и двухлетних (серия III) крысах Вистар, самцы массой 300 ± 30 г, самки – 250 ± 30 г. Животных содержали в стандартных виварных условиях при естественном световом режиме и свободном доступе к воде и пище. Способы воздействия на животных в трех сериях эксперимента обобщены в таблице 1.

В каждой серии эксперимента произвольно выделяли четыре группы животных (в каждой n = 7-10): 1) интактные; 2) контрольные – ложно-оперированные; 3) подвергнутые введению нейротоксичного агента; 4) подвергнутые введению нейротоксичного агента на фоне введения потенциального нейропротектора.

группа крыс, воздействие	серия эксперимента
	I	II	III
1. интактные	+	+	+
2. ложно-оперированные	NaCl	NaCl	NaCl
3. нейротоксичный агент	Аβ1-40	глутамат	глутамат
4. нейротоксичный агент + потенциальный нейропротектор	Аβ1-40 + 17β-эстрадиол	глутамат + 17β-эстрадиол	глутамат + нифедипин

Таблица 1. Схема экспериментов с лабораторными животными. Дозы, длительность и способ введения веществ приведены в тексте.

Ложнооперированные животные (группа животных 2), подвергались однократной инъекции 2 мкл 0.9% раствора NaCl в C1-область правого гиппокампа. Животные групп 3 и 4 подвергались однократной интрацеребральной (в ту же область мозга) инъекции агента, индуцирующего нейродегенеративные изменения: в I серии эксперимента – 2 мкл раствора, содержащего 5 мкг пептида Аβ1-40, во II и III – 2 мкл 1 мкМ раствора L-глутаминовой кислоты. Помимо инъекции нейротоксичного агента животным 4-й группы ежедневно в течение 14 дней с момента операции вводили 0.1 мг 17β-эстрадиола интраназально (I и II серии эксперимента) или 1 мг нифедипина per os (III серия). Интрацеребральная инъекция выполнялась в стерильных условиях под хлоралгидратным наркозом (400 мг/кг веса), забой проводили через две недели после операции декапитацией после аналогичной инъекции хлоралгидрата. Для оценки когнитивной функции крыс до и после оперативного вмешательства проводились поведенческие тесты в открытом лабиринте с параллельными ходами или в водном лабиринте Морриса.

Биохимические и гистоморфологические показатели оценивали в разных отделах головного мозга крыс: поврежденном инъекцией правом гиппокампе и в интактных левом гиппокампе и коре правого и левого больших полушарий.