Chastnaya_mikrobiologia

370 С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (5-10 %) в течение не менее 8 недель, просматривая посевы каждые 3 дня. Культуры М.tuberculosis растут в шероховатой R-форме в виде крошкообразных или морщинистых колоний кремового цвета (рис. 21). Отсутствие роста микобактерий спустя 8 недель после посева свидетельствует об отрицательном результате бактериологического метода диагностики туберкулеза.

Для культивирования микобактерий применяется также метод микрокультур Прайса. Для этого на нескольких узких предметных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабатывают несколько минут 2-6 % серной кислотой, после чего нейтрализуют. Затем стекла опускают в пробирки с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4-1:8 и ставят в термостат. Через 7- 14 стекла дней извлекают, препараты фиксируют, окрашивают по методу Циля-Нильсена и микроскопируют. Вирулентные штаммы микобактерий характеризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора.

Рис. 21. Колонии туберкулезной палочки на среде Левенштейна-Иенсена

Идентификация выделенной культуры микобактерий д о вида осуществляется по общепринятой схеме на основании изучения типичной морфологии, характерных культуральных свойств (по температурному оптимуму, скорости роста, пигментоообразованию в темноте и на свету), биохимической активности (наличие нитратредуктазы, каталазы, уреазы, пиразинамидазы, продукции никотиновой кислоты - ниациновая проба, восстановления нитратов и теллурита калия, гидролиза твина-80), а также с применением молекулярно-генетических (ДНК-гибридизация) и химических методов, что позволяет сократить время на лабораторную диагностику туберкулеза до 4-7 дней.

Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина; положительная реакция характеризуется появлением ярко-желтой окраски. После учета результатов реакции KCN нейтрализуют добавлением в пробирки 3-5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.

Проводится также определение чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам методом абсолютных концентраций ( наиболее часто на жидких питательных средах или методом микрокультур по Прайсу, занимая время от 3 недель до 3 месяцев или на плотной среде Левенштейна-Йенсена) с оценкой результатов по задержке роста или по нитратредуктазной активности, что имеет важное значение для назначения адекватной терапии. Границы устойчивости туберкулезной палочки составляют для стрептомицина 5 мкг/мл, ПАСК – 10 мкг/мл, тубазида – 1 мкг/мл, циклосерина и этионамида – 30 мкг/мл. Разработана также ПЦР для определения чувствительности микобактерий к химиопрепаратам и антибиотикам. К другим методам определения лекарственной устойчивости М.tuberculosis относятся биологический (LRP –Luciferase- Reporter Phage – свечение резистентных микобактерий в присутствии генетически измененных бактериофагов, несущих ген люциферазы) и молекулярно-генетический, основанный на ПЦР.

Биопроба ранее использовалась для выделения микобактерий путем подкожного заражения морской свинки (чувствительны к М.tuberculosis) и кролика (чувствительны к M.bovis)

71

материалом от больного с последующим наблюдением за животными (до 4 месяцев). По истечении этого срока или при гибели животных проводилось микроскопическое и бактериологическое исследование органов с целью обнаружения туберкулезных микобактерий. В настоящее время биопроба в реальной практике применяется редко в связи с утратой антибиотикорезистентных штаммов микобактерий вызывать типичную инфекцию и гибель животных.

Генодиагностика. Разработана ПЦР, позволяющая обнаружить видоспецифические нуклеиновые кислоты микобактерий комплекса МТС (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) непосредственно в клиническом материале от больного и дифференцировать туберкулезные микобактерии от нетуберкулезных – комплекс МАС (M. avium, M. kansassii). Метод ПЦР сопоставим с бактериологическим исследованием, однако выполняется быстро - в течение 24 часов.

При положительных результатах исследования методами бактериоскопии и ПЦР диагноз туберкулеза подтверждается и рекомендуется немедленное назначение противотуберкулезных препаратов по общепринятой схеме. Отрицательный результат ПЦР при обнаружении кислотоустойчивых микобактерии в мазках исключает наличие туберкулезных микобактерий комплекса МТС, поэтому в данной ситуации назначаются антимикробные препараты, активные в отношении нетуберкулезных микобактерии комплекса МАС. В других случаях необходимо ждать результатов бактериологического исследования.

Серодиагностика. Разработаны РСК, РНГА и другие серологические реакции для определения антител в сыворотке крови больных туберкулезом к антигенам микобактерий туберкулеза, однако диагностического значения эти реакции не имеют.

Аллергодиагностика. Ставится внутрикожная аллергическая проба (реакция Манту) с туберкулином - очищенной белковой фракцией, полученной из фильтрата убитой нагреванием бульонной культуры М.tuberculosis. Учет реакции производится через 24-48 часов. Проба используется для оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакцинации и отбора лиц для ревакцинации против туберкулеза.

Самостоятельная работа студентов

1.Микроскопическое исследование мокроты больного туберкулезом

(демонстрационный препарат, окраска по Цилю-Нильсену). В поле зрения микроскопа видны одиночные или в виде скоплений микобактерии, окрашенные в рубиново-красный цвет на голубом фоне препарата.

2.Изучение культуральных свойств возбудителя туберкулеза на среде Левенштейна-

Йенсена.

3.Определение лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза к химиотерапевтическим средствам на среде Левенштейна-Йенсена.

4.Ознакомление с препаратами, применяемыми для диагностики, лечения и профилактики туберкулеза:

туберкулин - фильтрат бульонной культуры микобактерий применяемый для постановки внутрикожной аллергической пробы Манту;

вакцина БЦЖ (BCG – Bacterium Calmett – Geren); живая вакцина из авирулентного штамма M.bovis, разработанная французскими учеными Кальметтом и Гереном. Применяется внутрикожно для активной специфической профилактики туберкулеза.

препараты для лечения туберкулеза (стрептомицин, ПАСК, тубазид, фтивазид, метазид, этионамид, этамбутол, пиразинамид, рифампицин, циклосерин, канамицин, фторхинолоны и т.д.)

Микробиологическая диагностика проказы

Материалом для исследования являются соскоб со слизистой оболочки носа, кожные лепрозные узлы, пунктат лимфатических узлов, мокрота и др.

Микроскопический метод является основным в лабораторной диагностике проказы, так как доступных методов культивирования возбудителя проказы не разработано. Единственным методом культивирования возбудителя проказы является заражение экзотических животных – броненосцев. В мазках из патологического материала, взятого от больного прока-

72

зой, палочка проказы (Mycobacterium leprae) при окраске по методу Циля-Нильсена окрашивается в рубиново-красный цвет и располагается в виде пачек сигар.

При проказе можно поставить кожную аллергическую пробу с лепромином (ре акция Мицуды), однако диагностического значения эта реакция не имеет и применяется для характеристики клинического течения болезни.

Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции

Возбудителями менингококковой инфекции являются менингококки (Neisseria meningitidis). Методы лабораторной диагностики менингококковой инфекции представлены в схеме 16. Учитывая высокую нежизнеспособность менингококка во внешней среде, исследование на менингококк выполняют как можно быстрее.

Схема 16. Микробиологическая диагностика менингококковой инфекции

Материал для исследования: спинномозговая жидкость, кровь, мазки со слизистой оболочки верхних отделов носоглотки, содержимое элементов сыпи

Микроскопический метод. Мазок из спинномозговой жидкости в окраске по Граму с целью выявления гноя и грамотрицательных диплококков внутри лейкоцитов в виде «бобов» или «кофейных зерен», обращенных вогнутой стороной друг к другу

Бактериологический метод.

1 день. Посев на сывороточный МПА с ристомицином. Культивирование при 370 С в течение 48 часов.

3 день. Учет характера роста на сывороточном МПА (мелкие, прозрачные, с голубоватым оттенком и ровными краями колонии; в мазках полиморфные грамотрицательные дипло- и тетракокки. Типичные для менингококка колонии пересевают на скошенный сывороточный МПА для выделения чистой культуры.

4-5 день. Идентификация выделенной чистой культуры менингококка и ее дифференциация от сапрофитных нейссерий на основании комплекса биологических свойств (рост на МПА, потребность в СО2, пигментообразование, ферментация углеводов, нитратредуктаза, антигенная структура - ОРА с менингококковыми сыворотками сероваров А, В, С). Окончательный ответ.

Серологический метод РНГА с парными сыворотками с целью обнаружения антител к менингококку (ретроспективная диагностика).

Генодиагностика - обнаружение специфических фрагментов ДНК менингококка с помощью ПЦР

Экспресс-методы - РИФ, непрямая латекс-агглютинация и РНГА с антительными диагностикумами с целью выявления антигенов менингококков в материале от боль-

ного

Микроскопический метод. Мазки из осадка спинномозговой жидкости окрашивают по методу Грама и микроскопируют. При наличии гноя и обнаружении внутри лейкоцитов грамотрицательных диплококков в виде «бобов» или «кофейных зерен», обращенных вогнутой стороной друг к другу, позволяет сделать положительное заключение о наличии у пациента менингококковой инфекции (рис. 22).

73

а б

Рис. 22. Менингококк (Neisseria meningitides) в спинно-мозговой жидкости больного эпидемическим цереброспинальным менингитом (а) и в чистой культуре (б). Окраска по Граму. х630

Микроскопическое исследование мазков из носоглотки бактерионосителей дает возможность выявить наряду с менингококком стафилококки, стрептококки и непатогенные нейссерии (Moraxella spp. и др.), дифференцировать которые по морфологическим и тинкториальным свойствам практически невозможно.

Бактериологический метод. Исследуемый материал засевают петлей на чашки с сывороточным МПА, содержащим антибиотики (ристомицин, ванкомицин, колистин и ниста - тин) для подавления роста сопутствующей микрофлоры (преимущественно кокков). Асцитическая жидкость в качестве добавки к питательным средам в настоящее вр емя не применяется, так как в результате лечения больных в ней накапливаются вещества, и н- гибирующие рост микроорганизмов (в том числе менингококка). М енингококк на сывороточном МПА вырастает при температуре 370 С в атмосфере с повышенным содержанием СО2 (используют СО2 инкубатор, газогенераторные пакеты или эксикатор с зажженной свечой) через 48 часов, колонии величиной с булавочную головку, прозрачные, с голубоватым оттенком и ровными краями. В мазках из чистой культуры менингококка (рис.21) микрокартина иная (полиморфные дипло- и тетракокки), чем в мазках из спинномозговой жидкости.

Типичные для менингококка колонии пересевают в пробирку со скошенным сывороточным МПА для выделения чистой культуры. Идентификацию чистой культуры менингококка, ее дифференциацию от сапрофитных нейссерий, обитающих в носоглотке, проводят на основании изучения комплекса биологических свойств (табл. 18).

Таблица 18. Основные биологические свойства нейссерий

74

Свойства		Виды нейссерий
	N.meningitidis	N.subflava	N.flava	N.mucosa	N.sicca
Рост на МПА	-	+	+	+	+
Потребность в СО2	+	-	-	-
Желтый пигмент	-	+	+	±	±
Ферментация: глюкозы	К+	К+	-	К+	К+
мальтозы	К+	К+	-	К+	К+
сахарозы	-	К±	-	К+	К+
фруктозы	-	К±	-	К+	К+
лактозы	-	-	-	-	-
Образование полисахарида из сахарозы	-	±	+	+	+
Нитратредуктаза	-	-	-	+	-
РА с менингококковыми сыворотками сероваров А., В, С	+	-	-	-	-

Обозначения: (+) – наличие признака, (-) – отсутствие признака, (±) – непостоянный признак, К – образование кислоты

Специфический полисахаридный менингококковый антиген можно выявить в спинномозговой жидкости с помощью метода встречного иммуноэлектрофореза в геле. С этой целью в агаровом геле на стеклянных пластинках, размером 9x12 см, вырезают два параллельных ряда лунок диаметром 3 мм. В лунки одного ряда вносят исследуемый ликвор, в лунки другого - преципитирующие сыворотки против менингококков разных серогрупп. Пластинки помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 40-45 мин при комнатной температуре. Положительный результат характеризуется появлением 1-2 полосок преципитации между лунками со спинномозговой жидкостью и соответствующей антисывороткой.

Геноди а гно ст ика . Исследуемый материал используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР, что дает основание в случае получения положительного результата поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Для ретроспективного подтверждения диагноза используют РНГА с парными сыворотками.

Экспресс-методы диагностики. Для выявления антигенов менингококков в мазках из исследуемого материала используют ИФМ, а также непрямую латекс-агглютинацию и РНГА с антительными диагностикумами.

Самостоятельная работа студентов

1.Микроскопический метод. Изучение морфологии менингококка в мазках из ликвора больного с подозрением на менингококковую инфекцию (демонстрация). Типично наличие грамотрицательных диплококков, располагающихся внутри лейкоцитов.

2.Бактериологический метод. Учет культуральных свойств менингококка на сывороточном МПА с ристомицином. Колонии менингококков прозрачные с голубым оттенком, ровные, мелкие (с булавочную головку). Изучить биохимические свойства менингококка в соответствии с таблицей .

3.Учесть демонстрационную РНГА с парными сыворотками больного (7 и 14 дни болезни) с подозрением на менингококковую инфекцию.

4.Биопрепараты для диагностики и профилактики менингококковой инфекции:

отечественная химическая вакцина полисахаридная менингококковая вакцина групп А и С. Применяется по эпидемиологическим показаниям. В России зарегистрирована также кубин-

75

ская В+С менингококковая вакцина, состоящая из белков менингококков группы В и полисахаридов менингококка группы С, а также полисахаридная вакцина МенингоА+С фирмы Пастер Мерье Коннот;

агглютинирующие и преципитирующие сыворотки против менингококка, применяются с диагностической целью для постановки РА с целью серологического типирования менингококка и встречного иммуноэлектрофореза для обнаружения менингококкового антигена в спинномозговой жидкости.

эритроцитарные антительные менингококковые диагностикумы для обнаружения антигенов менингококка в спинномозговой жидкости с помощью РНГА.

Микробиологическая диагностика актиномикоза

Материал для исследования биоптаты ткани и пунктаты из очагов поражения, гнойное отделямое, экссудат, мокрота, промывные воды бронхов, моча.

Микроскопический метод ориентирован на обнаружение в препаратах из исследуемого материала в нативных препаратах «раздавленной капли» или в окрашенных мазках друз актиномицетов – характерных зернистых образований с плотным гиалиновым центром, окруженным лучистыми нитевидными клетками или грамположительных ветвистых бактерий (рис. 22). Однако метод страдает субъективизмом и низкой чувствительностью, поэтому отрицательный результат микроскопического исследования не дает оснований отвергнуть диагноз актиномикоза.

Рис. 23. Друзы актиномицета. Окраска гематоксилин-эозином. Х400

Бактериологический метод заключается в посеве исследуемого материала на несколько специальных питательных сред (тиогликолевая среда, кровяной МПА, сердечно-мозговой МПА, среда Сабуро и т.д.) с последующим культивированием осуществляют при 370 С 18-24 часа в аэробных условиях с 5% содержанием СО2. По периферии образующихся микроколоний имеются многочисленные ветвящиеся нити. Через 1-2 недели формируются плоские морщинистые или бугристые зрелые колонии. Идентификация выделенной культуры проводится по совокупности биологических свойств.

Экспресс-методы диагностики актиномикоза – ИФМ с использованием для окраски мазков специфических флюоресцирующих сывороток к актиномицетам.

Генодиагностика. Разработана ПЦР для обнаружения специфических фрагментов ДНК актиномицетов.

Серологический метод. Применяется РСК для определения антител в сыворотке крови больных актиномикозом.

Аллергодиагностика – постановка кожной аллергической пробы с актинолизатом - экстрактом из инактивированных культур актиномицетов. Учет пробы через 24-48 часов.

Педиатрические аспекты темы

I. Подчеркнуть значение молока как возможного источника заражения детей туберкулезом 2. В связи с трудностью забора мокроты у детей производят исследование промывных вод

76

желудка.

3.Несмотря на успехи в борьбе с менингококковой инфекцией, в России ежегодно регистрируется заболеваемость этой инфекцией, имеются бактерионосители. В связи с этим важное практическое значение имеет обследование детей с подозрением на менингококковую инфекцию, контактировавших с ними лиц и возможных бактерионосителей с целью выделения чистой культуры и типирования менингококков.

4.При повышенной заболеваемости менингококковой инфекцией в регионе проводятся прививки по эпидемиологическим показаниям полисахаридной менингококковой вакциной.

После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей туберкулеза, менингококковой инфекции, актиномикоза,

атакже патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: оценивать результаты микробиологических анализов при туберкулезе, менингококковой инфекции, актиномикозе.

Тема 10. ВОЗБУДИТЕЛИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАЮЩИХСЯ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ: ГОНОРЕИ, СИФИЛИСА, БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА, УРОГЕНИТАЛЬНОГО ХЛАМИДИОЗА И МИКОПЛАЗМОЗА.

Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей бактериальных инфекций, передающихся половым путем – сифилиса, гонореи, бактериального вагиноза, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Трепонемы. Возбудитель сифилиса. Морфологические, культуральные свойства. Патогенез и иммуногенез. Микробиологическая диагностика и этиотропная терапия.

2 . Г он ок окк и . Таксономия. Биологические свойства. Патогенез гонококковой инфекции. Микробиологическая диагностика острой и хронической гонореи. Перспективы специфической профилактики. Этиотропное лечение гонореи и бленореи.

3.Хламидии. Таксономия. Биологические свойства возбудителей урогенитального хламидиоза и уреаплазмоза; их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемиология вызываемых заболеваний. Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза.

4.Биологические свойства возбудителей урогенитального микоплазмоза; их патогенность, экология, особенности инфекции и эпидемиология вызываемых заболеваний. Роль микоплазм в патологии беременности и поражении плода. Лабораторная диагностика урогенитального микоплазмоза.

5.Бактериальный вагиноз – этиология, лабораторная диагностика заболевания.

Микробиологическая диагностика бактериальных инфекций, передающихся половым путем

Возбудителями заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП или урогенитальные инфекции), являются бактерии, хламидии, вирусы, грибы, простейшие. Главные возбудители ЗППП бактериальной природы представлены в таблице 19. Урогенитальные инфекции могут вызывать также М.tuberculosis, возбудители гнойно-воспалительных инфекций, энтеробактерии и другие микроорганизмы.

Таблица 19. Бактерии - возбудители ЗППП и вызываемые ими инфекции

Микроорганизмы	Инфекции
Treponema palladium	Сифилис
Neisseria gonorrhoeae	Гонорея, бленнорея
Haemophilus ducreyi	Мягкий шанкр
Chlamydia trachomatis	Урогенитальный хламидиоз
	Венерическая лимфогранулема

77

Calymmatobacterium granulomatis	Паховая гранулема
Mycoplasma hominis	Урогенитальный микоплазмоз
Ureaplasma urealyticum	Уреаплазмоз
Gardnerella vaginalis	Гарднереллез (вагиноз, вагинит)
Mobiluncus spp.	Бактериальный (анаэробный) вагиноз

Микробиологическая диагностика сифилиса

Возбудителем сифилиса - хронической инфекции со специфическим поражением кожи, внутренних органов и нервной системы, является бледная трепонема (Treponema palladium). Методы лабораторной диагностики этой инфекции зависят от ее стадии.

Материалом для микроскопического исследования при сифилисе являются отделяемое твердого шанкра, пунктат лимфатических узлов, отделяемое слизистых оболочек и кожи при вторичном сифилисе, а также сыворотка крови и спинномозговая жидкость для серологической диагностики. Методы микробиологической диагностики сифилиса представлены в схеме 17.

Микроскопический метод (темнопольная микроскопия с высокой разрешающей способностью) обычно применяется при первичном сифилисе при исследовании отделяемого твердого шанкра. Бледная трепонема имеет 8-12 равномерных мелких завитков правильной формы, обладает характерным плавным штопорообразным вращательно-поступательным, маятникообразным, сгибательным и контрактильным движением. На половых органах встречаются непатоген-

ные Treponema refringens и Treponema balantidis, а в полости рта Treponema microdentium и Treponema buccalis, которые необходимо дифференцировать по морфологическим свойствам от бледной трепонемы. В силу этих обстоятельств темнопольной микроскопия желательно подвергнуть пунктат регионарных лимфатических узлов. Применяется также дифференциация Treponema palladium от непатогенных трепонем методом люминесцентной микроскопии с моноклональными или поликлональными антителами, который является одновременно экспрессметодом диагностики сифилиса (рис. 24).

Схема 17. Методы микробиологической диагностики сифилиса

Исследуемый материал: отделяемое твердого шанкра, пунктат лимфатических узлов, отделяемое слизистых оболочек и кожи при вторичном сифилисе, а также сыворотка крови и спинномозговая жидкость ( для серологической диагностики).

Микроскопический метод - темнопольная микроскопия, окраска спирохеты по Романов- скому-Гимзе, Бурри, импрегнацией серебром по Морозову

Серологический метод – МР, ИФА, РНГА, РИФ, РИБТ, РСК для определения антител к бледной спирохете в крови больного

Генодиагностика - ПЦР

78

Рис. 24. Бледная спирохета (Treponema palladum). Прямая РИФ. х900

Методы окраски бледной спирохеты (по Романовскому-Гимзе, при котором она окрашивается в бледно-розовый цвет, импрегнацией серебром по Морозову), а также метод Бурри (изготовление негативных препаратов в капле туши) с последующим исследованием препаратов в обычном световом микроскопе имеют низкую воспроизводимость и существенно уступают темнопольной микроскопии по степени разрешающей способности, поэтому в реальной практике эти методы не применяются.

Бактериологический метод диагностики сифилиса не применяется в связи с трудностью культивирования бледных трепонем и отсутствием эффективных питательных сред.

Серологический метод. Рекомендуется использование следующих методов серодиагностики сифилиса, направленных на обнаружение в крови больных специфических антител к бледной трепонеме:

Для проведения отборочных исследований на сифилис ставят неспецифический тест - микрореакцию преципитации (МР). В лунку полистироловой пластины вносят 3 капли исследуемой сыворотки и 1 каплю кардиолипинового антигена, смесь встряхивают и учитывают результаты. Положительная реакция характеризуется выпадением хлопьев. МР обладает высокой чувствительностью и специфичностью, хорошо сочетается с подтверждающими диагноз специфическими трепонемными тестами, позволяет объективно оценить эффективность лечения, однако необходимо ее подтверждение одним из специфических тестов (ИФА, РНГА, РИФ, РИБТ, РСК).

ИФА применяется как для отборочных целей, так и для диагностики сифилиса. Разработаны тест-системы для определения антител к бледной спирохете классов G и M, что имеет важное значение для диагностики ранних форм сифилиса (в том числе врожденного), дифференциальной диагностики рецидивов, реинфекции, оценки эффективности лечения и т.д.

РНГА также используется для целей отбора и диагностики. Обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем другие серологические реакции при сифилисе, отличается простотой в постановке.

РИФ сопоставима по своим результатам с ИФА и РНГА. Сыворотку больного адсорбируют взвесью непатогенных трепонем или разводят 1:200, наносят на предметное стекло, содержащее фиксированные ацетоном бледные трепонемы из тестикул зараженного кролика, после чего на препарат наносят люминесцирующий иммуноглобулин кролика против глобулинов человека. Мазки исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, отмечая при положительном результате наличие ярко-зеленого свечения трепонем.

РИБТ. Сущность реакции заключается в способности антител к бледной трепонеме иммобилизировать (обездвиживать) их в присутствии комплемента. Подсчитывают процент иммобилизации, при этом при показателе 0-20% реакция считается отрицательной, от 21 до 50% - слабо положительной, от 51 до 100% - положительной.

79

РСК ставится по общепринятой методике с неспецифическим кардиолипиновым (экстракт липидных фракций из бычьего сердца – реакция Вассермана) и специфическим (из разрушенных ультразвуком трепонем) антигенами. Положительная реакция характеризуется задержкой гемолиза.

Иммуноблотинг – вариант ИФА для определения антител в крови больного к антигенам бледной спирохеты.

В настоящее время ставится вопрос о повсеместном введении более информативных, простых и экономичных ИФА и РНГА для диагностики сифилиса с одновременной отменой РСК и РИБТ.

Генодиагностика. Разработана ПЦР и метод ДНК-зондов для диагностики сифилиса.

Самостоятельная работа студентов

1.Микроскопическое исследование материала от больного с целью обнаружения бледной трепонемы:

изучение препарата "раздавленная капля" (тканевой сок из твердого шанкра) методом темнопольной микроскопии (демонстрация). Обратить внимание на наличие в поле зрения микроскопа тонких, извитых спирохет с 10-12 равномерными завитками. Отметить типичные маятникообразные и поступательные движения бледной трепонемы.

изучение тушевого препарата (по Бурри) из материала от больного (тканевой сок из твердого шанкра);

2.Серологическая диагностика сифилиса.

Учет РСК с кардиолипиновым и специфическим трепонематозным антигеном (демонстрация).

Постановка и учет реакции микропреципитации с инактивированной сывороткой крови больного с подозрением на сифилис. Компоненты реакции:

- инактивированная сыворотка крови больного А - инактивированная сыворотка крови больного Б - инактивированная сыворотка крови больного В - контрольная положительная сыворотка крови - кардиолипиновый антиген - изотонический раствор хлорида натрия,

Методика постановки микрореакции: В лунки планшета для иммунологических реакций внести по 3 капли сывороток крови больных А,Б,В и контрольной положительной. В каждую лунку добавить по I капле кардиолипинового антигена, для перемешивания ингредиентов встряхивать планшет 5 минут. Внести во все лунки по 3 капли изотонического раствора хлорида натрия. Перемешать, покачивая планшет, и оставить на столе на 5 минут. Учет результатов произвести после появления хлопьев в лунке с контрольной положительной сывороткой (планшет рассматривать над лампой на столе),

учет результатов ИФА с сыворотками крови больных А, Б, В с подозрением на сифилис (демонстрация). В верхнем ряду лунок планшета поставлены контроли:

-контроль положительной сыворотки (2 лунки, коричневое окрашивание),

-контроль отрицательной сыворотки (2 лунки, светло-бежевое окрашивание),

-контроль конъюгата (2 лунки, светло-бежевое окрашивание),

-контроль субстратной смеси (4 лунки, коричневое окрашивание).

Во 2-4 рядах лунок исследуются сыворотки крови больных А (2-й ряд), Б (3-й ряд) ,В (4-й ряд) в разведении 1:200. Результаты реакции оценивают по изменению цвета смеси со светлобежевого в коричневый.

РИФ. На предметном стекле готовят мазок из культуральных трепонем, затем наносят исследуемую сыворотку больного в разведении I; 200 на 30 мин, промывают препарат забуференным физиологическим раствором и докрашивают мазок флюоресцирующей сывороткой против глобулинов человека. Препарат исследуют в люминесцентном микроскопе, отмечая интенсивность свечения трепонем. Реакция высокочувствительна и специфична.

80