Chastnaya_mikrobiologia

РИТ. Сущность реакции состоит в подавлении движения бледных трепонем (иммобилизация) антителами сыворотки крови больного в присутствии комплемента. С этой целью к взвеси тканевых спирохет добавляют исследуемую сыворотку больного и свежий комплемент. Параллельно ставят 2 контрольные пробы, в одной вместо исследуемой сыворотки берут сыворотку крови здорового человека, в другой вместо свежего комплемента инактивированный. Выдерживают все пробы в анаэробных условиях, готовят препарат "раздавленной капли" и исследуют с помощью микроскопии в темном поле, определяя количество подвижных и неподвижных трепонем. Расчет процента иммобилизации трепонем (ПИТ) осуществляют по формуле:

(А-B)х100

А

где А - количество подвижных трепонем в контроле (с неактивным комплементом), B - число подвижных трепонем в опыте. Если процент иммобилизации выше 50, результат положителен.

РНГА с эритроцитарным трепонемным антигеном (демонстрация)

3. Ознакомиться с препаратами для диагностики и лечения сифилиса:

специфический антиген из тканевых трепонем, разрушенных ультразвуком, для РСК;

неспецифический кардиолипиновый антиген - экстракт липидных фракций бычьего сердца для постановки реакции Вассермана (РСК);

антибиотики: пенициллин, цефотаксим, тетрациклины, эритромицин.

Микробиологическая диагностика мягкого шанкра

Материалом для исследования является отделяемое язвы – мягкого шанкра. Микроскопический метод заключается в исследовании препаратов из отделяемого мяг-

кого шанкра, окрашенных по Граму и метиленовым синим. Возбудитель мягкого шанкра (Haemophilus ducreyi) выглядит в виде длинных цепочек грамотрицательных палочек.

Бактериоскопический метод осуществляют путем посева материала на кровяные питательные среды, на которых Haemophilus ducreyi через 48-72 часа образует мелкие круглые колонии, окруженные зоной гемолиза. Идентификацию выделенной культуры проводят на основании изучения биохимических (посев на среды «пестрого» ряда) и антигенных (постановка РА на стекле) свойств.

Микробиологическая диагностика гонореи

Возбудителем гонореи является Neisseria gonorrhoeaе, вызывающая острые и хронические воспалительные поражения мочеполовых органов, слизистой оболочки ротоглотки и конъюнктивы глаза.

Материалом для исследования является гнойное отделяемое мочеполовых органов, прямой кишки или конъюнктивы глаз (при бленорее), суставной и перитонеальный экссудат. Строго регламентированными методами лабораторной диагностики гонореи являются микроскопическое и бактериологическое (культуральное) исследование. Методы микробиологической диагностики гонореи отражены в схеме 18 .

Схема 18. Методы микробиологической диагностики гонореи

Исследуемый материал: гнойное отделяемое мочеполовых органов, прямой кишки или конъюнктивы глаз (при бленорее), суставной и перитонеальный экссудат.

Микроскопический метод – мазки, окрашенные по Граму и метиленовым синим

Бактериологический метод – посев на специальные сывороточные питательные среды с антибиотиками. Через 24-72 часа культивирования учет характера роста (колонии в виде «росы»), пересев типичных колоний на сывороточный МПА и идентификация культуры по морфологическим, культуральным, биохимическим свойствам, тест на оксидазу и анти-

биотикорезистентность Серологический метод - РСК, ИФА строго не регламентированы, диагностического значе-

ния не имеют

Генодиагностика - ПЦР

81

Микроскопический метод заключается в исследовании мазков из исследуемого материала, окрашенных по Граму и метиленовым синим. При окрашивании препаратов на гонорею используют модификацию метода Грама (краситель генциан-виолет заменяют кристал-виолетом, а вместо фуксина применяют нейтральный красный; промывку препарата осуществляют после каждого этапа окраски). В мазках при острой гонорее обнаруживают большое количество полиморфноядерных лейкоцитов, внутри и вне которых расположены бобовидные грамотрицательные диплококки; сопутствующая микрофлора либо минимальна, либо отсутствует вовсе (рис. 25). При хронической гонорее в ряде случаев типичный гонококк в мазках не выявляется, либо выглядит нетипично в виде мелких пылевидных или крупных шарообразных образований, нередко 2 клетки гонококка располагаются под углом друг к другу, при этом обнаруживается обильная сопутствующая микрофлора, лейкоциты, эпителиальные и другие клетки. В качестве экспресс-метода диагностики может использоваться ИФМ.

Рис. 25. Возбудитель гонореи (Neisseria gonorrhoeaе) в мазках из уретры больного острой гонореей. Внутри и внеклеточно расположенные грамотрцательные диплококки, обилие лейкоцитов.

Бактериологический метод. Гонококк отличается высокой чувствительностью к различным неблагоприятным факторам, поэтому культуральное исследование необходимо проводить сразу после отбора материала. Посев производят на специальные питательные среды. Основой этих сред является МПА из кроличьего мяса с добавлением дрожжевого аутолизата, гидролизата казеина или гемогидрализата и сыворотки крупного рогатого скота. Асцитическая жидкость

ияичный желток в качестве добавок к среде для культивирования гонококка в настоящее время не применяются. Второй тип питательных сред является селективным и включает в свой состав,

помимо вышеуказанных компонентов, антибиотики (полимиксин, линкомицин, а для диагностики фарингеальной гонореи – оротовую кислоту). Посевы выращивают при 370 С в течение

24-72 часов в атмосфере с повышенным содержанием СО2. Колонии гонококков круглые, прозрачные, в виде капелек росы. Типичные для гонококков колонии пересевают в пробирки со средой для культивирования гонококка для получения чистых культур, которые идентифицируют по морфологическим и сахаролитическим свойствам на средах "пестрого" ряда (полужидкий агар с сывороткой и углеводом) или с помощью микротест-систем. В мазках из чистых культур гонококки располагаются не попарно, а отдельно. В биохимическом отношении гонококки малоактивны

иферментируют только глюкозу с образованием кислоты, вырабатывают оксидазу. Для выявления оксидазы применяют пробу с 1% водным раствором диметилпарафенилендиамина или диэтилпарафенилендиамина, которые окрашивают колонии гонококка сначала в розовый, затем в красный, а через несколько минут – в черный цвет. Исследуют также чувствительность гонококков к антибиотикам и его бета-лактамазную активность.

82

Серологический метод (определение антител к гонококку в крови пациентов с помощью РСК и ИФА) не является строго регламентированным, не представляет диагностической ценности, не является методом контроля эффективности проводимого лечения и в реальной практике в настоящее время не используется.

Генодиагностика. Направлена на обнаружение специфических фрагментов ДНК гонококка с помощью ПЦР и может быть использована в качестве дополнительного высокоинформативного метода диагностики гонореи.

Самостоятельная работа студентов

1.Микроскопический метод - исследование гнойного отделяемого из уретры больного с подозрением на гонорею (демонстрационный микропрепарат, окраска по Граму).

2.Бактериологический метод. Изучение культуральных. возбудителя гонореи на питательной среде для выделения гонококка, на которой гонококки образуют круглые, прозрачные колонии в виде капелек росы. В ферментативном отношении гонококк малоактивен и ферментирует лишь глюкозу с образованием кислоты. Учесть результаты посева гонококка на «пестрый» ряд (демонстрация).

3.Изучить препараты для диагностики и лечения гонореи.

Гонококковая вакцина – взвесь убитых нагреванием Neisseria gonorrhoeae для лечения хронической гонореи.

Микробиологическая диагностика урогенитального микоплазмоза

Возбудителями урогенитального микоплазмоза и уреаплазмоза являются 3 вида мико-

плазм из 2 родов: Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum, реже - Mycoplasma genitalium.

Исследованию подвергают выделения из уретры, шейки матки и влагалища, сперму, мочу. Лабораторная диагностика микоплазмозов базируется, в основном, на бактериологических и иммунофлюоресцентных исследованиях, а также на ПЦР.

Микроскопический метод заключается в исследовании мазков из исследуемого материала, окрашенных люминесцирующими сыворотками против микоплазм. При люминесцентной микроскопии микоплазмы выявляются в виде зеленого гранулярного свечения на мембранах эпителиальных клеток и во внеклеточном пространстве.

Бактериологический метод. Микоплазмы относятся к прихотливым микроорганизмам и для их культивирования применяются специальные жидкие, полужидкие и плотные питательные среды. Для определения Ureaplasma urealyticum используется ее способность разлагать мочевину, находящуюся в составе специальной питательной среды (бульон PPLO – триптический перевар бычьего сердца или триптиказо-соевый бульон, дрожжевой экстракт, мочевина, L- цистеин, лошадиная сыворотка, пенициллин, амфотерицин, линкомицин, индикатор бромтимоловый синий). При наличии в материале уреаплазм цвет среды меняется с лимонно-желтого на изумрудный, а при наличии высоких концентраций уреаплазм на синий. Созданы тест-системы,

позволяющие одновременно выявлять Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum.

На плотных питательных средах Mycoplasma hominis растет в виде характерных колоний, напоминающих «яичницу-глазунью» (рис. 26).

83

Рис. 26. Колонии Mycoplasma hominis

Идентификация и дифференциация различных видов микоплазм проводится по биохимическим и антигенным свойствам (табл. 20). Mycoplasma hominis, в отличие от других микоплазм, не ферментирует углеводы и разлагает аргинин.

Таблица 20. Основные биологические свойства микоплазм, вызывающих урогенитальные

инфекции

Свойства	Виды микоплазм
	Mycoplasma hominis	Ureaplasma urealyticum
Рост на МПА с метиленовым синим	-	-
Устойчивость к ацетату таллия	+	-
Колонии в виде «яичницы-глазуньи»	+	-
Ферментация:
глюкозы	-	-
мочевины	-	К
аргинина	К	-
Гемолиз эритроцитов:
барана	γ	α
морской свинки	γ	β
лошади	α γ	γ
человека	γ	α

Обозначения: (+) – наличие признака, (-) – отсутствие признака, К – кислота.

Серологический метод. Имеются тест-системы для ИФА, применяющиеся с целью определения антител в сыворотке крови больных микоплазмозом.

Генодиагностика. Для диагностики микоплазмозов разработана ПЦР.

Лабораторная диагностика урогенитального хламидиоза

Возбудителем урогенитального хламидиоза – инфекции, вызывающей уретриты, цервициты, сальпингиты, эпидидимиты и конъюнктивиты, является Chlamydia trachomatis.

Материалом для исследования при хламидиозе являются мазки со слизистой оболочки мочеиспускательного канала, выделения из шейки матки, соскобы, мазки-отпечатки и др.

Микроскопический метод исследования мазков из исследуемого материала в окраске по методу Романовского-Гимзе в настоящее время практически не применяется. Распространенными методами исследования при хламидиозе являются прямая и непрямая, в основе которых лежит обработка мазков специфическими флюоресцирующими антителами антителами против хламидий (прямая РИФ), либо обработка мазка нелюминесцирующими антителами против хламидий, а затем антивидовой люминесцирующей сывороткой (непрямая РИФ). При исследовании препаратов в люминесцентный микроскоп антигены хламидий обнаруживаются в цитоплазме клеток в виде единичных ярко-зеленых элементарных или ретикулярных телец (рис. 27 ).

Культуральный метод. Выделение хламидий осуществляется путем заражения исследуемым материалом культур клеток McCoy, HeLa и других линий. Через 48 часов культивирования в термостате при 370 С выявляют включения возбудителя в клетках иммунофлюоресцентным методом. Выделение хламидий в культуре клеток имеет важное диагностическое значение, позволяет выявить жизнеспособные хламидии и определить их чувствительность к антимикробным препаратам.

Генодиагностика. Разработана ПЦР для определения специфических фрагментов ДНК хламидий.

Серологический метод включает постановку РСК, РНГА и ИФА для определения антител различных классов (IgG, IgM, IgA) к хламидиям в сыворотке крови больных с подозрением на хламидиоз. С учетом низкой иммуногенности хламидий и возможности наличия специфических антител после перенесенной ранее хламидиозной инфекции рекомендуется исследование нескольких проб сыворотки крови в динамике заболевания с интервалом в 2-3 недели. Тест-системы для

84

ИФА дают возможность дифференцировать различные классы антител к хламидиям. При остром процессе в крови чаще выявляются антитела IgM, а также быстро нарастающие или быстро снижающиеся антитела IgG и IgA. При хронически протекающем хламидиозе чаще определяются стабильные концентрации антител IgG и IgA, титры которых снижаются в ходе эффективно проводимой терапии.

Рис. 27. Элементарные и ретикулярные тельца Chlamydia trachomatis в мазках со слизистой оболочки уретры. Прямая РИФ. х630

Самостоятельная работа студентов

1.Демонстрация фотографий колоний Mycoplasma hominis на питательной среде. Об-

ратить внимание на характерный вид колоний в виде «яичницы-глазуньи».

2.Выявление уреаплазм на среде с мочевиной. Отметить изменение цвета индикатора среды (бромтимоловый синий) с исходного лимонно-желтого на зеленый в результате расщепления мочевины с образованием щелочных продуктов.

3.Серологический метод диагностики урогенитальных инфекций - учет демонстра-

ционной ИФА по выявлению специфических антител в сыворотках крови больных микоплазмозом и хламидиозом.

4.Генодиагностика хламидиоза – учет ПЦР (демонстрация).

Микробиологическая диагностика бактериального вагиноза

Бактериальный вагиноз связан с перераспределением микрофлоры влагалища, в результате чего при этом заболевании на фоне подавления лактобактерий наблюдается массивный рост широкого спектра микроорганизмов (гарднерелл – Gardnerella vaginalis, пептококков, стрептококков, мобилункуса, бактероидов, микоплазм и др.). Диагностическое значение при этом заболевании является наличие не менее 3 из 4 признаков:

характер вагинальных выделений (серовато-белого цвета, пенистых, с неприятным за-

пахом);

рН вагинального отделяемого >4,5;

положительный аминный тест (рыбный запах), усиливающийся при смешивании патологического материала с 10% раствором КОН;

выявление «ключевых» клеток (эпителиальные клетки, с адгезированными на них мелкими грамвариабельными палочками) при микроскопическом исследовании вагинальных мазков.

Лабораторная диагностика бактериального вагиноза основана на применении следующих методов.

Микроскопический метод – исследование влагалищных мазков, окрашенных по Граму и метиленовым синим с целью выявления «ключевых клеток» (рис. 28). В мазках, помимо гард-

85

нерелл, часто обнаруживаются также дрожжеподобные грибы рода Кандида, грамотрицательная микрофлора, мобилункус.

Бактериологический метод. Для выделения гарднерелл наиболее часто применяют колумбийский агар (панкреатический перевар казеина и тканей животных, дрожжевой экстракт, бычий экстракт, крахмал, NaCl) с 5% донорской крови и антибиотиками ( гентамицин, налидиксовая кислота, амфотерицин). Культивирование осуществляют в атмосфере 5-10% СО2. Колонии гарднерелл через 48-72 часа культивирования гладкие, круглые, сероватые, блестящие, диаметром 0,1-0,5 мм с зоной β-гемолиза. В морфологическом отношении гарднереллы сначала грамотрицательные, затем грамвариабельные коккобактерии, ферментирующие различные углеводы, гиппурат, крахмал.

Генодиагностика. Разработана ПЦР для выявления специфических участков ДНК гарднерелл.

Другие методы лабораторной диагностики бактериального вагиноза (газожидкостная хроматография с целью определения летучих жирных и нелетучих органических кислот, а также хромато-масс-спектрометрия для анализа липидов гарднерелл) практического распространения не получили из-за высокой стоимости исследований и оборудования.

Рис. 28. Ключевые клетки во влагалищном мазке больной бактериальным вагинозом. Окраска метиленовым синим. х900

Самостоятельная работа студентов.

1. Микроскопическое исследование влагалищных мазков при бактериальном вагинозе (окраска по Граму, демонстрация). Обратить внимание на «ключевые» клетки (эпителиоциты, покрытые мелкими грамвариабельными коккобактериями на фоне отсутствия лактобактерий).

После изучения темы студент должен знать: таксономию, морфологические и биологические свойства возбудителей бактериальных инфекций, передающихся половым путем, а также патогенез, эпидемиологию, основные клинические проявления и иммунитет; основные методы диагностики, специфической профилактики и лечения этих инфекций.

Изучив тему, студент должен уметь: оценивать результаты микробиологических анализов при бактериальных инфекциях, передающихся половым путем.

ТЕМА 11. ВОЗБУДИТЕЛИ РИККЕТСИОЗОВ.

Цель занятия: изучение биологических свойств основных возбудителей риккетсиозов, методов их лабораторной диагностики, профилактики и лечения.

Перечень конкретных учебно-целевых вопросов

1. Риккетсии, эрлихии, коксиеллы, их таксономическое положение. 2.Бартонеллы.Таксономия. Биологические свойства. Роль в патологии человека. Микро-

биологическая диагностика. Этиотропная терапия.

86

3.Классификация риккетсий и риккетсиозов.

4.Морфология, биологические свойства и методы культивирования риккетсий.

5.Возбудители эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля–Цинссера, эндемического сыпного тифа, клещевого сыпного тифа (северо-азиатского риккетсиоза), лихорадки цуцугамуши. Возбудитель Ку-лихорадки. Возбудители эрлихиозов. Биологические свойства. Экология. Хозяева и переносчики. Резистентность. Культивирование. Внутриклеточный паразитизм. Антигенная структура. Факторы патогенности. Патогенность для человека и животных. Иммунитет. Лабораторная диагностика. Этиотропная терапия. Специфическая профилактика.

Микробиологическая диагностика риккетсиозов

Риккетсиозы у человека и животных (12 нозологических форм) вызываются риккетсиями, подразделяющимися на 5 групп в зависимости от особенностей возбудителей и переносчиков:

I - группа сыпного тифа;

II - группа клещевых риккетсиозов;

III - группа лихорадки цуцугамуши; IV - эрлихиозы человека и животных; V - группа лихорадки Ку.

Риккетсии относятся к прокариотам, представляя собой мелкие полиморфные, грамотрицательные палочки, коккобактерии или нитевидные формы. Риккетсии являются облигатными паразитами, на искусственных питательных средах не растут и размножаются только в живой клетке. Риккетсии удается выделить путем заражения кровью больных риккетсиозами культур ткани (Vero, HeLa и др.), куриных эмбрионов, насекомых-переносчиков или экспериментальных животных. Наиболее часто в настоящее время используется метод культивирования риккетсий на культуре ткани. Выделение риккетсий проводится обычно с научными целями в специализированных лабораториях.

Культуральный метод. Исследуемый материал вносят в лунки пластиковых планшетов или пробирок с культурой ткани, инкубируют 48-72 часа при 340 С в атмосфере 5 % СО2, после чего клетки промывают, фиксируют и окрашивают люминесцирующими сыворотками (прямая РИФ) против риккетсий для обнаружения возбудителя в клетках. Идентификацию выделенных риккетсий проводят также методом ПЦР.

Серологический метод является основным методом при лабораторной диагностике риккетсиозов. Его применяют с целью обнаружения антител к риккетсиям в крови больных с подозрением на риккетсиоз, используя РСК, РИФ, РА, ИФА, иммуноблотинг и другие иммунологические реакции.

Генодиагностика. В последнее время для диагностики риккетсиозов применяют метод ПЦР для детекции специфических фрагментов ДНК непосредственно в клиническом материале (кожные биоптаты, лимфоциты периферической крови, ликвор, клетки эндотелия и др.).

Микробиологическая диагностика эпидемического сыпного тифа.

Возбудителем эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля-Цинссера (рецидивного сыпного тифа) является риккетсия Провачека (Rickettsia prowazekii), вызывающая у человека острое заболевание с внезапным началом, тифозным статусом (высокая температура тела, бред) и характерной сосудистой розеолезно-петехиальной сыпью в результате развития васкулита.

Культуральный метод - выделение риккетсий Провачека из крови больных или от насеко- мых-переносчиков - вшей путем заражения куриного эмбриона в желточный мешок, вшей или культур клеток связан с высоким риском лабораторного заражения и проводится в редких случаях в специальных лабораториях. Риккетсии можно обнаружить в ядре или цитоплазме инфицированных клеток микроскопическим методом при окраске по методу Романовского—Гимзе в виде полиморфных мелких микроорганизмов, окрашенных в пурпурно-фиолетовый цвет, а при окраске по Здродовскому — в ярко-красный. Обнаружить риккетсий в материале можно также с помощью РИФ (прямой вариант) и ПЦР.

Серологический метод диагностики с целью определения уровня сыпнотифозных антител и динамики их нарастания в сыворотке крови больных с подозрением на сыпной тиф является ведущим в лабораторной диагностике этой инфекции. Применяется РСК (диагностический титр

87

1:20), РА с диагностикумами из риккетсий Провачека (диагностический титр 1:160) , РНГА, непрямая РИФ. Диагностическое значение имеет 4-кратное нарастание титра антител в парных сыворотках. РСК позволяет диагностировать как активную форму болезни, так и перенесенную в прошлом (ретроспективный диагноз), дифференцировать эпидемический и эндемический (крысиный) сыпной тиф, а также первичный сыпной тиф от болезни Брилля - Цинссера (рецидива).

Микробиологическая диагностика эндемического сыпного тифа.

Возбудитель эндемического (крысиного) сыпного тифа (Rickettsia typhi) вызывает заболевание, сходное по клиническим проявлениям с эпидемическим сыпным тифом, поэтому лабораторная дифференциация этих двух инфекций имеет важное значение для постановки точного диагноза и для целей эпидемиологии.

Серологический метод играет важную роль в дифференциации эндемического и эпидемического сыпного тифа. Применяются РСК и РА с антигенами из Rickettsia prowazekii и Rickettsia typhi. При эндемическом сыпном тифе титр сывороточных антител к Rickettsia typhi в 3-4 раза превосходит титр к Rickettsia prowazekii.

Биопроба. При отсутствии культуры ткани проводят внутрибрюшинное заражение кровью больных морских свинок-самцов. Появление скротальной реакции (периорхит), лихорадки и выявление риккетсий во влагалищных оболочках яичек подтверждает диагноз эндемического сыпного тифа.

Микробиологическая диагностика Ку-лихорадка.

Возбудитель Ку-лихорадки (Coxiella burnetii - риккетсии Бернета) вызывает острое (реже подострое или хроническое) инфекционное заболевание с полиморфной клинической картиной. Для лабораторной диагностики этого риккетсиоза применяют серологический метод (РА, РСК), в некоторых случаях - непрямую РИФ, биологическую и кожно-аллергическую пробы.

Серологический метод является основным в лабораторной диагностике Ку-лихорадки. Серологические реакции (РА и РСК) для определения антител к Coxiella burnetii в парных пробах сыворотки крови больных Ку-лихорадкой ставят с антигенами I фазы (иммуногенный ЛПС) и II фазы (малоиммуногенный антиген) возбудителя. Диагностический титр 1:4.

Аллергодиагностика. Кожную аллергическую пробу проводят по обычной методике (0,1 мл аллергена внутрикожно), используя в качестве аллергена растворимый антиген из риккетсий Бернета I фазы, автоклавированную культуру коксиелл или ЛПС I фазы. Результаты пробы учитывают через 24-48 ч по наличию и размерам инфильтрата, гиперемии, отека. Проба специфична, но пригодна только для ретроспективной диагностики. У переболевших она остается положительной в течение 10 лет.

Биопроба - внутрибрюшинное или интратестикулярное (в толщу яичек) заражение исследуемым материалом морских свинок самцов, куриных эмбрионов в желточный мешок. Обнаружение риккетсий осуществляется в мазках-отпечатках внутренних органов, окрашенных по Романовско- му-Гимзе или Здродовскому. В настоящее биопроба в реальной практике не используется в связи с внедрением культур тканей для культивирования и выделения риккетсий.

Микробиологическая диагностика лихорадки цуцугамуши.

Лихорадка цуцугамуши вызывается Orientia tsutsugamushi и характеризуется лихорадкой, поражением нервной системы и органов кровообращения в результате развития множественных васкулитов.

Материалом для исследования служат кровь, взятая в период лихорадки, для выделения возбудителя, а также сыворотка крови для серологической диагностики.

Культуральный метод. Возбудитель лихорадки цуцугамуши в материале от больного можно выделить путем заражения перевиваемой культуры клеток L и на клетках первичнотрипсинизированных фибробластов куриного эмбриона.

Серологический метод. Проводится со второй недели болезни. Для определения специфических антител в крови больных используют ИФА, РА (с антигеном из культуры Proteus mirabilis OXk), непрямую РИФ, РСК.

Биопроба. Кровью больного внутрибрюшинно заражают белых мышей, которые через 6-14 дней погибают. Риккетсии выявляют в мазках-отпечатках внутренних органов животного, окра-

88

шенных по Романовскому— Гимзе, Здродовскому или люминесцирующими сыворотками про-

тив Orientia tsutsugamushi.

. Микробиологическая диагностика риккетсиозов группы пятнистой лихорадки Скали-

стых гор.

К этой группе риккетсиозов относятся марсельская (Астраханская) лихорадка (возбудитель Rickettsia conorii), осповидный (везикулярный) риккетсиоз (возбудитель Rickettsia akari) пятнистая лихорадка Скалистых гор (возбудитель Rickeftsia rickettsii), клещевой сыпной тиф Сибири и Северной Азии (возбудитель Rickettsia sibirica).

Биопроба – внутрибрюшинное заражение материалом от больного морских свинок самцов или белых мышей. Риккетсии этой группы вызывают у морских свинок через 6-14 дней после заражения скротальный феномен с некрозом мошонки, а у белых мышей (возбудитель везикулезного риккетсиоза) - перитонит.

Серологический метод. Для обнаружения антител в сыворотках крови больных со 2 недели заболевания в динамике (исследование парных сывороток) используют непрямую РИФ, ИФА, РСК, РНГА. Нарастание титра антител в 4 и более раз в динамике болезни подтверждает диагноз риккетсиоза.

Микробиологическая диагностика эрлихиозов

Эрлихии (Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia equi, Ehrlichia sennetsu)

поражают фагоциты (тканевые макрофаги, моноциты - Е. chqffeensis, гранулоциты - Е. phagocytophila ) животных и человека, вызывая острую трансмиссивную генерализованную инфекцию, сопровождающуюся лихорадкой, генерализованной лимфаденопатией, изменениями формулы крови и вторичным иммунодефицитом. При эрлихиозах, в отличие от других риккетсиозов, присасывание клеща не приводит к развитию первичного аффекта. Клиническая диагностика эрлихиозов затруднительна из-за отсутствия характерной симптоматики.

Лабораторная диагностика эрлихиоза включает следующие методы.

Микроскопический метод состоит в микроскопии мазков из крови больного, в которых при окраске по Романовскому—Гимзе компактные пурпурные скопления эрлихий (морулы) находятся в цитоплазме лейкоцитов в виде тутовой ягоды или малины.

Культуральный метод Культуральный метод более чувствителен, чем микроскопический. Возбудитель выделяют из крови путем длительного культивирования (до 4 недель) на перевиваемых культурах ткани (Vero, ТНР-1, HeLa или др.), которые систематически (2 раза в неделю) проверяются на присутствие эрлихий в мазках, окрашенных по Романовскому—Гимзе, с помощью ИФМ или ПЦР.

Генодиагностика заключается в постановке ПЦР, являющейся информативным методом выявления эрлихий.

Серологический метод является ретроспективным; для определения специфических антител к эрлихиям применяется непрямая РИФ и иммуноблотинг.

Микробиологическая диагностика бартонеллезов

Бартонеллы, в отличие от риккетсий, растут на искусственных питательных средах. Бартонеллы поражают эндотелий сосудов и эритроциты, приводя к развитию ангиоматоза или анемии. У человека бартонеллы вызывают острые (волынская или окопная пятидневная лихорадка, возбудитель Bartonella quintana; болезнь Карриона или лихорадка Оройя с эндемическим распространением, возбудитель Bartonella bacilliformis), подострые (болезнь кошачьих царапин, возбудитель Bartonella henselae) и хронические (бациллярный ангиоматоз, перуанская бородавка, пурпурный гепатит, эндокардиты и др., возбудитель Bartonella bacilliformis) инфекции.

Микроскопический метод. Бартонеллы могут быть обнаружены в исследуемом материале от больного с помощью РИФ.

Бактериологический метод заключается в посеве крови от больного на специальные полужидкие и плотные питательные среды с гемином и 5-10% крови человека или животных (барана, кролика). Посевы выращивают при 370 С (В. bacillifomis — при 21-300 С) в атмосфере с 5-10% СО2 в течение длительного времени (45-60 дней). Идентификацию бартонелл осуществляют на ос-

89

новании изучения морфологических (подвижность) и биохимических (наличие каталазы, оксидазы, нитратредуктазы и др.) свойств.

Серологический метод играет важную роль в постановке диагноза бартонеллеза. Для определения в крови больных антител к бартонеллам применяют ИФА, РНГА, РИФ.

Самостоятельная работа студентов

1.Микроскопический метод. Изучение морфологии риккетсий Провачека, Музера и Бернета (демонстрационные микропрепарата). Окраска по Романовскому-Гимзе. Препараты описать, зарисовать.

2.Методы культивирования риккетсий. Для культивирования риккетсий применяют развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ). Заражение проводят в желточный мешок. Риккетсии также можно культивировать в первично-трипсинизированных и перевиваемых тканевых культурах, а также в организме чувствительных лабораторных животных. Морских свинок заражают внутрибрюшинно, риккетсии накапливается в мезотелии оболочек яичка и вызывают специфический периорхит.

Морфологию выделенных риккетсий изучают в препаратах из содержимого РКЭ и культур тканей, окрашивают по Романовскому-Гимзе или по Здродовскому. Применяется также иммунофлюоресцентный метод.

Для диагностики риккетсиозов в обычных лабораториях применяют серологический метод, а в клинике - кожные аллергические пробы.

3.Серологический метод диагностики сыпного тифа:

Учет демонстрационной РА риккетсий с целью выявления антител в крови больных сыпным тифом. Диагностический титр I:I60.

Учет РНГА с сывороткой крови больного сыпным тифом. В реакции используется растворимый риккетсиозный антиген, адсорбированный на эритроцитах. Диагностический титр 1/200. (Демонстрация).

Учет РCK, поставленной с целью дифференцировки первичного сыпного тифа и болезни Брилля, основанную на том, что при первичном сыпном тифе формируются антитела иммуноглобулина класса М, а при рецидиве сыпного тифа (болезнь Брилля) - класса G. РСК ставят с цельной сывороткой крови и сывороткой, обработанной цистеином, который вызывает распад молекулы IgM. В результате реакции при первичном сыпном тифе антитела в обработанной цистеином сыворотке определяются в более низком титре, чем в цельной сыворотке. При болезни Брилля выше количество Ig G и поэтому титры антител в обработанной цистеином и необработанной сыворотках существенно не отличаются.

4.Диагностика Ку-лихорадки. Серологический метод:

Учет демонстрационной РА с парными сыворотками больного сыпным тифом с целью определения нарастания титра сыпнотифозных антител. Диагностический титр 1:100. На 3 - 5 неделе заболевания титры антител увеличивается в 10 и более раз.

Учет демонстрационной РСК, поставленной с парными сыворотками крови больного Ку-лихорадкой. Диагностический титр 1:100.

5.Изучение препаратов, используемых для диагностики, специфической профилактики и лечения риккетсиозов, хламидиозов, микоплазмозов.

риккетсиозные диагностикумы (Провачека, Музера, Бернета) - взвесь убитых риккетсий, применяющиеся для постановки реакции агглютинации с целью выявления антител в сыворотке крови больных риккетсиозами.

живая комбинированная сухая сыпнотифозная вакцина для специфической профилактики сыпного тифа.

сухая живая вакцина для профилактики Ку-лихорадки.

ку-аллерген - взвесь убитых нагреванием риккетсий для постановки кожной аллергической пробы. Вводится внутрикожно, учет реакции через 24-48 часов.

Педиатрические аспекты темы

90