3.3 Поиск физиологически активных аналогов сск-4

Было известно, что многие пептиды, в частности, аналоги гастроинтерального гормона холецистокинина(ССК), состоящего из 33 аминокислот (ССК-33), при парентеральном введении обладают способностью существенно влиять на психоэмоциональный статус. ССК пептиды функционируют в центральной нервной системе(ЦНС) как нейромодуляторы и участвуют в регуляции поведенческих реакций, болевых ощущений, процессов памяти и обучения.

В связи с этим следует ожидать, что модуляция ССК системы является основой для лечения и предупреждение психотических заболеваний.

Наиболее перспективным направлением при поиске средств купирования психических расстройств является конструирование аналогов эндогенных пептидов, который характеризуются минимальной токсичностью и отсутствием побочных эффектов. В этом аспекте актуальны разработка и синтез соединений на основе нейропептидов – антагонистов минимального физиологически активного С-концевого фрагмента холецистокинина – пептида ССК-4. ССК-4 - селективный агонист к холецистокининовым рецепторам второго типа, которые вовлечены в формирование психоэмоционального состояния.

Пространственная структура рецептора была получена из базы данных Protein Data Bank (www.spdb.org). Оптимизацию молекул проводили с применением метода молекулярной механики BIO+ и полуэмпирическим квантово-химическим методом PM3, которые реализованы в программном комплексе HyperChem. В итоге по результатам молекулярного моделирования были получена наиболее вероятная биологически активная конформация молекулы ССК-4, которая представлена на рисунке 7.

Рисунок 7 – Биологически активная конформация ССК-4

Исходя из структуры биологической конформации были предложены аналоги. В ходе данной работы были получены следующие результаты:

1) Методами молекулярного моделирования сконструирована вероятная биологически активная конформация пептида ССК-4, а также разработана пространственная модель взаимодействия лиганда ССК-4 с активным центром холецистокининового рецептора второго типа.

2) С использованием квантохимических расчетов разработанной модели взаимодействия пептида ССК-4 и холецистокининового рецептора второго типа предложен вероятный механизм лиганд-рецепторного взаимодействия, заключающийся в одновременном переносе протона амидной группы N-концевой группы фенилаланина и перераспределением электронной плотности с молекулы лиганда ССК-4 на аминокислоту активного центра рецептора.

3) На основании рассчитанных дескрипторов предложены новые высокоактивные соединения – аналоги ССК-4.

4) Синтезированы предложенные аналоги.

5) Проведены экспериментальные исследования по оценке биологической активности синтезированных аналогов. Установлено, что аналоги превосходят стандарт в 3,6-4,1 раза по антагонистической активности [13].

4. Анализ примеров

Анализ приведенных примеров позволяет предложить следующую схему использования компьютерного моделирования в создании новых лекарственных препаратов:

1) Анализ литературы по фармацевтической химии и синтезу лекарственных препаратов. Поиск моделей структур соединений и рецепторов в базах данных, полученных методами ЯМР и рентгеноскопии. Примерами баз данных служат SPDB, CSD.

2) В случае отсутствия компьютерных моделей препарата строят модель и оптимизируют модель квантово-химическими расчетами в программном комплексе HyperChem или аналогичном;

3) Анализ биологической активности путем совмещения модели рецептора клетки-мишени или путем использования метода QSAR в программе PASS;

4) По сделанным выводам о биологической активности предлагают модификации, улучшающие свойства молекулы. При этом должна использоваться литература по фармацевтической химии и синтезу лекарственного препарата;

5) Построение модели в HyperChem, анализ биологической активности методами виртуального докинга или QSAR с использованием HyperChem и PASS, соответственно;

6) Синтез новой структуры и лабораторные испытания.

Заключение

В ходе данной работы было проанализированы работы о применимости методов моделирования в практике, а именно при создании новых препаратов и изучении механизма действия химического соединения и рецепторов клетки мишени.

По результатам анализа можно с уверенностью сказать, что молекулярное моделирование является эффективным методом разработки новых лекарственных препаратов, позволяющим сэкономить время при отборе новых структур и деньги, затрачиваемые на синтез новых структур для отбора. Но применение данной методики связано с определенными трудностями, так как требует высококвалифицированных кадров. Также это требует высокие вычислительные мощности оборудования и соответствующее программное обеспечение, которое требует больших финансовых затрат.

Рациональный дизайн новых лекарственных средств

Историческая справка

Индустрия направленного конструирования новых лекарственных препаратов, или, как этот процесс называют, калькируя с английского за неимением такого же короткого и удобного русского термина, драг-дизайн (drug — лекарственный препарат, design — проектирование, конструирование) — сравнительно молодая дисциплина, но все же не настолько молодая, как это принято считать.

К концу девятнадцатого века химия достигла значительной степени зрелости. Была открыта таблица Менделеева, разработана теория химической валентности, теория кислот и оснований, теория ароматических соединений. Этот несомненный прогресс дал толчок и медицине. Новые химические продукты — синтетические краски — начали использоваться в медицине для дифференциального окрашивания биологических тканей. В 1872—1874 годах в Страсбурге, в лаборатории известного анатома Вильгельма Валдеера, студент-медик Пауль Эрлих, изучавший селективную окраску тканей, впервые выдвинул гипотезу о существовании хеморецепторов — специальных тканевых структур, специфически взаимодействующих с химическими веществами, и постулировал возможность использования этого феномена в терапии различных заболеваний. Позже, в 1905 году, эта концепция была расширена известным английским физиологом и гистологом Джоном Лэнгли, предложившим модель рецептора как генератора внутриклеточных биологических импульсов, регулирующих работу клетки.

Этот момент можно считать рождением хемотерапии и новым витком в фармакологии, и в 20-м веке это привело к беспрецедентному успеху в клинической медицине. Одним из самых громких достижений фармакологической промышленности 20-го века можно по праву назвать пенициллин — антибиотик, открытый в 1929 году Александром Флемингом и исследованный впоследствии Чейном и Флори. Пенициллин, обладающий антибактериальным действием, сослужил человечеству незаменимую службу в годы Второй Мировой войны, сохранив жизни миллионам раненых.

Пораженные успехом пенициллина, многие фармацевтические компании открыли собственные микробиологические подразделения, возлагая на них надежды по открытию новых антибиотиков и других лекарств. Последовавшие успехи биохимии привели к тому, что стало возможным теоретически предсказывать удачные мишени для терапевтического воздействия, а также модификации химических структур лекарств, дающих новые соединения с новыми свойствами. Так, антибиотик сульфаниламид в результате ряда исследований дал начало целым семействам гипогликемических, диуретических и антигипертензивных препаратов. Драг-дизайн поднялся на качественно новый уровень, когда разработка новых лекарственных соединений стала не просто плодом работы воображения химиков, а результатом научного диалога между биологами и химиками.

Новый прорыв был связан с развитием молекулярной биологии, позволившей клонировать («размножать») гены, кодирующие терапевтически важные биологические мишени, и нарабатывать достаточное для исследований количество этих белков с помощью генетически модифицированных организмов.

Завершение ознаменовавшего начало нового тысячелетия проекта «геном человека», в результате которого была прочитана полная информация, содержащаяся в человеческой ДНК, стало настоящим триумфом раздела биологической науки, получившего название «геномика». Геномика дает совершенно новый подход к поиску новых терапевтически важных мишеней, позволяя искать их непосредственно в нуклеотидном «тексте» генома. Развивающаяся стремительными темпами персональная геномика [3, 4] обещает ещё более захватывающие перспективы: «молекулярный план» лечения будет составляться для каждого пациента индивидуально. Кстати, в наши дни уже возможно «прочесть» геномы не только отдельных индивидуумов, но и отдельных типов клеток (например, раковых), что позволит, в конце концов, установить причины онкологических заболеваний.

Любая болезнь на молекулярном уровне является следствием нарушения работы белков и/или кодирующих их генов. Геном человека содержит около 20 000 генов, кодирующих белки; действие же «сегодняшних» лекарств направлено не более чем на 500 «мишеней». В то же время, многие заболевания обусловлены дисфункцией не одного, а как минимум 5—10 связанных между собой белков и кодирующих их генов. Из этого следует, что у фармацевтической промышленности есть ещё солидный запас по мишеням, на которые будут действовать лекарства будущего.

Биохимическая классификация исследуемых в настоящее время биологических мишеней и их численное соотношение представлены на рисунке 1. Особо следует отметить, что бoльшую (>60%) долю рецепторов составляют мембранные G-белоксопряженные рецепторы (GPCR, G-protein coupled receptors), а суммарный объем продаж лекарств, направленных на взаимодействие с ними, равняется ориентировочно 65 млрд. долл. ежегодно, и продолжает расти.

Рисунок 1.Классификация молекулярных мишеней в современной фармацевтической индустрии, согласно биохимическому критерию

Базовые понятия

Основные понятия, используемые в драг-дизайне — это мишень и лекарство. Мишенью называют макромолекулярную биологическую структуру, предположительно связанную с определенной функцией, нарушение которой приводит к заболеванию. Корректно спланированное воздействие на мишень способно улучшить течение заболевания или вылечить его. Наиболее часто встречающиеся мишени — это рецепторы и ферменты. Лекарство — это химическое соединение (как правило, низкомолекулярное), специфически взаимодействующее с мишенью и тем или иным образом модифицирующее воздействие, оказываемое ей на клетку.

Если в качестве мишени выступает рецептор, то лекарство будет, скорее всего, его лигандом, — то есть соединением, специфически взаимодействующим с активным сайтом рецептора. В отсутствие лиганда рецептор характеризуется собственным уровнем клеточного ответа — так называемой базальной активностью (см. рис. 2).

Рисунок 2. Три типа влияния лигандов на клеточный ответ. (1) Агонисты, связываясь с рецептором, увеличивают ответ; (2) Нейтральные агонисты, хотя связываются с рецептором и конкурируют за связывание с другими лигандами, не изменяют клеточный ответ; (3) Антагонисты (или обратные агонисты) ингибируют клеточный ответ.

Степень взаимодействия лиганда с мишенью измеряют аффинностью, или сродством. Аффинность равна концентрации лиганда, при которой половина мишеней связана с лигандом. Биологической же характеристикой лиганда является его активность (объяснено на рис. 2), то есть та концентрация лиганда, при которой клеточный ответ равен половине максимального.

Поиск мишени

Один из самых ранних и самых важных этапов драг-дизайна — выбрать правильную мишень, воздействуя на которую можно специфическим образом регулировать одни биохимические процессы, по возможности не затрагивая при этом другие. Однако, как уже было сказано, такое не всегда возможно: в развитии большинства заболеваний участвует больше одного белка или гена, а в разных тканях организма нормальные и патологические процессы протекают по-разному.

С наступлением постгеномной эры, определение мишеней происходит с использованием методов сравнительной и функциональной геномики. На основании филогенетического анализа в геноме человека выявляют гены, родственные генам с уже известной функцией, и затем их выделяют (клонируют) для дальнейшего исследования. Кстати, такого рода предсказания уже удаётся довольно качественно формализовать, в результате чего подобные открытия уже под силу не учёным, а... роботам.

Однако мишени, чьи функции определены лишь гипотетически, не могут служить отправной точкой для длительной и дорогостоящей разработки. Необходима тщательная экспериментальная валидация (проверка), в результате которой может быть понята конкретная биологическая функция мишени применительно к фенотипическим проявлениям исследуемой болезни. Существует множество методов экспериментальной валидации мишеней:

Геномные методы позволяют подавлять синтез мишени в тестовой системе путем получения мутантов с генным нокаутом (в которых ген мишени попросту отсутствует) или использования РНК-антисмысловых последовательностей, «выключающих» тот или иной ген;

Инактивация мишени с помощью моноклональных антител или низкомолекулярных лигандов-ингибиторов;

Разрушение мишени, модифицированной хромофором, с помощью лазера;

«Прямая» валидация мишени — установление её взаимодействия с тем или иным соединением (например, методом плазмонного резонанса).

Уровень надёжности валидации повышается с числом модельных животных (специальных генетических линий лабораторных животных), в которых модификация мишени приводит к желаемому фенотипическому проявлению. Высшим уровнем валидации является, несомненно, демонстрация того, что модификация мишени (например, блокирование или нокаут рецептора или ингибирование фермента) приводит к клинически идентифицируемым и воспроизводимым симптомам у человека. Однако по понятным причинам такое можно наблюдать достаточно редко.

При выборе мишени не следует забывать о полиморфизме: любой ген может существовать в нескольких вариантах у разных популяций или рас людей, что может привести к разному эффекту лекарства на разных больных.

Поиск действующего вещества

Когда мишень уже найдена и её роль в развитии заболевания экспериментально подтверждена, начинаются исследования, непосредственным результатом которых являются многочисленные предсказанные структуры химических соединений — потенциальных прототипов лекарств, — лишь немногим из которых суждено стать «конечными» продуктами.

Исследование всех возможных с химической точки зрения соединений («химическое пространство») невозможно: простая прикидка показывает, что возможно не менее 1040 различных лигандов, в то время как с момента возникновения вселенной прошло лишь ~1017 секунд. Поэтому на возможную структуру лигандов накладывается ряд ограничений, который существенно сужает химическое пространство (оставляя его, тем не менее, совершенно необъятным). В частности, для сужения химического пространства накладываются условия подобия лекарству (drug-likeness), которые в простом случае можно выразить «правилом пяти» Липинского, согласно которому соединение, чтобы «быть похожим» на лекарство, должно:

Иметь менее пяти атомов-доноров водородной связи;

Обладать молекулярным весом менее 500;

Иметь липофильность (logP — коэффициент распределения вещества на границе раздела вода-октанол) менее 5;

Иметь суммарно не более 10 атомов азота и кислорода (грубая оценка количества акцепторов водородной связи).

Если для «нашей» мишени известны природные агонисты, то один из наиболее очевидных путей — поиск их аналогов, превосходящих свои природные прототипы по требуемым качествам. Однако если такой «отправной точки» нет, или она по каким-то причинам не устраивает исследователей (например, пептиды имеют очень малое «время жизни» в организме, и чаще всего не подходят на роль лекарств), поступают иначе. В качестве стартового набора лигандов в этом случае обычно используют так называемые библиотеки соединений, либо поставляемые на коммерческой основе специализирующимися на этом компаниями, либо имеющиеся в арсенале фармацевтической компании, проводящей разработку нового лекарства. Такие библиотеки могут содержать тысячи и миллионы соединений. Этого, конечно, совершенно недостаточно для тестирования всех возможных вариантов, но этого, как правило, и не требуется. Основная задача на этом этапе — выявление соединений, проявляющих хотя бы небольшую активность требуемого свойства по отношению к мишени. Эти молекулы оптимизируют для увеличения сродства и/или селективности к мишени, и получают «кандидат» — соединение, предназначенное для тестирования на животных (доклинические исследования) и на людях (клинические исследования).

Этап «просеивания» баз соединений осуществляется с помощью высокопроизводительного скрининга — экспериментального (in vitro — в лаборатории) или «виртуального» (in silico — на компьютере).

Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг

Скринингом (или сканированием) называется конвейеризованная процедура, в результате которой большое количество химических соединений (>10000) проверяется на аффинность или активность по отношению к специальной тестовой системе, имитирующей биологическую. По производительности различают разные виды скрининга:

Низкопроизводительный (10000-50000 образцов);

Среднепроизводительный (50000-100000 образцов);

Высокопроизводительный (100000-5000000+ образцов).

Для скрининга как для «промышленной» процедуры очень критична эффективность, стоимость и время, потраченное на операцию. Как правило, скрининг производится на роботизированных установках, способных работать в круглосуточном и круглогодичном режиме (см. рис. 3).

Рисунок 3. Аппаратура, используемая для высокопроизводительного скрининга.

А. Роботизированная пипетка, в автоматическом высокопроизводительном режиме наносящая образцы тестируемых соединений в плашку с системой для скрининга. Типичное количество углублений на плашке — тысячи. Объем системы в одной лунке — микролитры. Объем вносимого образца — нанолитры.

Б. Установка для высокопроизводительного скрининга и считывания флуоресцентного сигнала Mark II Scarina. Работает с плашками, содержащими 2048 углублений (NanoCarrier). Полностью автоматическая (работает в круглосуточном режиме). Производительность —100000+ лунок (образцов) в день.

Принцип скрининга достаточно прост: в плашки, содержащие тестовую систему (например, иммобилизованная мишень или специальным образом модифицированные целые клетки), робот раскапывает из пипетки исследуемые вещества (или смесь веществ), следуя заданной программе. Причем на одной плашке могут находиться тысячи «лунок» с тестовой системой, и объем такой лунки может быть очень мал, так же как и объем вносимой пробы.

Потом происходит считывание данных с плашки, говорящее о том, в какой лунке обнаружена биологическая активность, а в какой — нет. В зависимости от используемой технологии детектор может считывать радиоактивный сигнал, флуоресценцию (если система построена с использованием флуоресцентных белков), биолюминесценцию (если используется люциферин-люциферазная система или ее аналоги), поляризацию излучения и многие другие параметры.

Обычно в результате скрининга количество тестируемых соединений сокращается на 3—4 порядка. Соединения, для которых в процессе этого эксперимента выявлена активность выше заданного значения, называются прототипами. Однако следует понимать, что такие «удачи» еще очень и очень далеки от конечного лекарства. Лишь те из них, которые сохраняют свою активность в модельных системах и удовлетворяют целому ряду критериев, дают предшественников лекарств, которые используются для дальнейших исследований.

Как уже было сказано, даже библиотеки, содержащие более миллиона соединений, не в состоянии представить все возможное химическое пространство лигандов. Поэтому при проведении скрининга можно выбрать две различные стратегии: диверсификационный или сфокусированный скрининг. Различие между ними заключается в составе используемых библиотек соединений: в диверсификационном варианте используют как можно более непохожие друг на друга лиганды с целью охватить как можно большую область химического пространства, при сфокусированном же, наоборот, используют библиотеки родственных соединений, полученных методами комбинаторной химии, что позволяет, зная «приблизительную» структуру лиганда, выбрать более оптимальный его вариант. Здравый смысл подсказывает, что в масштабном проекте по созданию нового лекарственного препарата следует проводить два этих этапа сканирования последовательно — сначала диверсификационный, с целью определения максимально различных классов удачных соединений, а потом — сфокусированный скрининг, с целью оптимизации структуры соединений и получения рабочих прототипов.

Если для мишени известно так называемое биологическое пространство — то есть какие-либо характеристики связываемых ею лигандов (размер, гидрофобность и т. д.), — то при составлении библиотеки тестируемых соединений выбирают лиганды, попадающие в «пересечение» биологического и химического пространств, так как это позволяет отсеять заведомо бесперспективные соединения.

Фармакологический цикл

Структуры прототипов, полученные в результате скрининга, подвергаются не одному раунду модификаций с целью удовлетворить разнообразным требованиям, налагаемым на реальное лекарственное вещество. Эта оптимизация происходит в тесном сотрудничестве между различными группами исследователей: молекулярными биологами, фармакологами, специалистами по компьютерному моделированию и медицинскими химиками (см. рис. 4).

С каждым оборотом такого «фармакологического цикла» прототип приближается к предшественнику лекарства, который уже тестируется непосредственно на животных (доклинические испытания) и на людях — в процессе клинических испытаний. Таким образом, роль скрининга заключается в существенном (на несколько порядков) сокращении выборки прототипов (см. рис. 5).

Рисунок 4. Фармакологический цикл. Группа молекулярной биологии отвечает за получение мутантных белков-мишеней, группа фармакологии — за измерение данных по активности и аффинности синтезированных лигандов на мишенях дикого типа и мутантных, группа компьютерного моделирования — за построение пространственной структуры мишеней, предсказание их мутаций и предсказание структур лигандов, группа медицинской химии — за синтез лигандов.

Рисунок 5. Роль высокопроизводительного скрининга в разработке нового лекарственного препарата. Скрининг, будь то его лабораторный (in vitro) или компьютерный (in silico) вариант, — главная и наиболее ресурсоемкая процедура по выбору стартовых структур лекарств (прототипов) из библиотек доступных соединений. Выходные данные скрининга часто являются отправной точкой для дальнейшего процесса разработки лекарства.

Клинические исследования

Медицина — это область, в которой ни в коем случае не следует спешить. В особенности, если речь идет о разработке новых лекарственных препаратов. Достаточно вспомнить историю с препаратом талидомидом, разработанным в конце 50-х в Германии, применение которого беременными женщинами приводило к рождению детей с врожденными пороками конечностей, вплоть до их полного отсутствия. Этот побочный эффект не был вовремя выявлен во время клинических исследований в силу недостаточно тщательного и аккуратного тестирования.

Поэтому в настоящее время процедура тестирования лекарств достаточно сложна, дорога и требует значительного времени (2—7 лет тестирования в клинике и от 100 миллионов долларов на одно соединение-кандидат, см. рис. 6).

Рисунок 6. Процесс разработки нового лекарства занимает от 5 до 16 лет. Затраты на клиническое тестирование одного соединения-кандидата составляют более 100 миллионов долларов США. Суммарная стоимость разработки, с учетом препаратов, не достигших рынка, часто превышает 1 миллиард долларов.

Прежде всего, еще до поступления в клинику, препараты исследуются на токсичность и канцерогенность, причем исследования должны проводиться, кроме систем in vitro, как минимум на двух видах лабораторных животных. Токсичные препараты, само собой, в клинику не попадают, за исключением тех случаев, когда они предназначены для терапии особо тяжелых заболеваний и не имеют пока менее токсичных аналогов.

Кроме того, препараты подвергаются фармакокинетическим исследованиям, то есть тестируются на предмет таких физиологических и биохимических характеристик, как поглощение, распределение, метаболизм и выведение (по-английски обозначается аббревиатурой ADMET — Absorption, Distribution, Metabolism, Extraction and Toxicity). Биодоступность, например, характеризует введение препарата в организм, и означает скорость потери им биологических свойств (распад) при различных видах приёма: перорально (через рот), внутривенно и др. Так, инсулин, принимаемый перорально, имеет низкую биодоступность, поскольку, будучи белком, он расщепляется желудочными ферментами. Поэтому инсулин вводят либо подкожно, либо внутримышечно. По этой же причине часто разрабатывают препараты, действующие аналогично своим природным прототипам, но имеющие небелковую природу.

Юридически процессы клинических исследований и регистрации новых препаратов имеет много нюансов, так как они требуют огромного количества сопроводительной документации (в сумме несколько тысяч страниц), разрешений, сертификатов и т. д. Кроме того, многие формальные процедуры сильно разнятся в разных странах в силу различного законодательства. Поэтому для решения этих многочисленных вопросов существуют специальные компании, принимающие от фармацевтических концернов заказы на проведение клинических испытаний и перенаправляющие их в конкретные клиники, сопровождая весь процесс полной документацией и следя, чтобы никакие формальности не были нарушены.

Роль компьютерной техники в драг-дизайне

В настоящее время в драг-дизайне, как и в большинстве других наукоемких областей, продолжает увеличиваться роль вычислительной техники. Следует сразу оговорить, что современный уровень развития компьютерных методик не позволяет разработать новый лекарственный препарат, используя только компьютеры. Основные преимущества, которые дают вычислительные методы в данном случае — это сокращение времени выпуска нового лекарства на рынок и снижение стоимости разработки. Основные компьютерные методы, используемые в драг-дизайне, это:

Предсказание пространственной структуры мишеней и их активных центров;

Виртуальный скрининг;

Дизайн новых лекарственных препаратов de novo;

Оценка свойств «подобия лекарству»;

Моделирование связывания лиганд-мишень.

Моделирование, основанное на структуре лиганда

В том довольно обычном случае, когда трёхмерная структура белка-мишени неизвестна, дизайн новых соединений может производиться на основе данных о структуре и активности уже известных лигандов.

Подход основывается на общепринятой в химии и биологии парадигме, гласящей, что структура молекулы определяет её свойства. Изучив связь между структурой известных соединений и их свойствами, можно сконструировать новую молекулу, обладающую желаемыми характеристиками. (А можно и наоборот: для известной структуры предсказать свойства.) Эти методы используются как для модификации известных структур с целью улучшения их свойств, так и при поиске новых соединений в компьютерных базах молекул.

Один из таких подходов позволяет устанавливать количественную связь между структурой и активностью (QSAR, Quantitative Structure-Activity Relationship), анализируя сходство так называемых молекулярных полей (CoMFA, Comparative Molecular Field Analysis). Подход заключается в приближении трехмерной структуры лиганда набором молекулярных полей, отдельно характеризующих его пространственные, электростатические, донорно-акцепторные и другие свойства. CoMFA-модель строится на основе анализа набора лигандов с известной активностью и описывает соединение, которое должно хорошо связываться с исследуемой мишенью. Полученный набор «молекулярных полей» указывает, в каком месте у лиганда должен быть объемный заместитель, а в каком — маленький, в каком полярный, а в каком — нет, в каком донор водородной связи, а в каком — акцептор, и т. д.

Подобные модели могут использоваться в задачах виртуального скрининга библиотек соединений, играя роль фармакофора — то есть, выступая «слепком» активного центра исследуемой мишени. Самым главным недостатком методов группы QSAR является то, что они обладают высокой предсказательной силой лишь на близких классах соединений, использовавшихся для построения модели; при попытке же предсказать активность веществ иной химической природы, результат может оказаться недостаточно достоверным.

«Похожесть» молекул между собой также можно оценивать с помощью дескрипторов (значений, количественно характеризующих те или иные свойства молекулы, — например, число доноров и акцепторов водородной связи или бензольных колец, наличие какого-либо заместителя в определенном положении и т. д.). Задавшись набором дескрипторов, принимающих ряд заданных значений, молекулу можно описать числовой последовательностью определённой длины. Сравнивая эти последовательности («отпечатки») между собой, можно оценивать степень «похожести» двух молекул. Высокая похожесть предполагает близость свойств сравниваемых молекул, и наоборот — и эти закономерности также позволяют сканировать базы данных на предмет молекул с необходимыми характеристиками.

Схема возможного процесса создания нового лекарства, основывающаяся на структуре лиганда, приведена на рисунке 7.

Рисунок 7. Пример молекулярного моделирования, основывающегося на структуре лиганда. Для циклического пептида уротензина II (внизу слева) определена трехмерная структура методом ЯМР-спектроскопии водного раствора (вверху слева). Пространственное взаиморасположение аминокислотных остатков важного для биологической функции мотива ТРП-ЛИЗ-ТИР было использовано для построения модели фармакофора (вверху справа). В результате виртуального скрининга найдено новое соединение, демонстрирующее биологическую активность (внизу справа).

Очевидно, что достоверность моделирования, как и эффективность всего процесса конструирования нового лекарства, можно существенно повысить, если учитывать не только структуру и свойства лигандов, но и информацию о строении белка-мишени. Методы, учитывающие эти данные, носят общее название структурно-подкреплённого драг-дизайна (SBDD, Structure-Based Drug Design).

Учёт трёхмерного строения белка

В связи с растущим потенциалом структурной биологии, всё чаще можно экспериментально установить пространственную структуру мишени или построить её теоретическую модель, основываясь на эволюционном родстве с белком, чья трёхмерная структура уже определена.

Наиболее часто используемые методы определения трехмерной структуры биомакромолекул с высоким разрешением (<3 A) — это спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и рентгеновская кристаллография (РСА, рентгеноструктурный анализ). РСА способен дать детальную трехмерную структуру мишени, если удаётся получить кристалл исследуемого белка, пригодный для изучения дифракции рентгеновских лучей; с помощью ЯМР-спектроскопии можно узнать не только строение молекулы, но и оценить подвижность отдельных её участков (как правило, только для сравнительно небольших глобулярных белков).

Часто, когда экспериментальная структура мишени все же недоступна, прибегают к моделированию на основании гомологии — методу предсказания пространственной структуры белка, основанному на предположении об эволюционном родстве с другим белком, структура которого уже известна. (Подход базируется на наблюдении, что пространственное строение белка значительно более консервативно, чем его аминокислотная последовательность)

Особенно часто к моделированию по гомологии прибегают при разработке лекарств, направленных на интегральные рецепторы мембраны клетки, действующие через активацию G-белков (GPCR-рецепторы), так как они, будучи мембранными белкaми, очень плохо поддаются кристаллизации, и недоступны для изучения методом ЯМР-спектроскопии из-за своего большого размера. Для этого обширного семейства рецепторов известны структуры только нескольких белков — зрительного рецептора родопсина, до недавнего времени бывшего единственным «шаблоном» при моделировании по гомологии, адренорецепторов, а также аденозинового рецептора, строение которых удалось установить лишь недавно.

В любом исследовании учитывают также доступную информацию по мутагенезу мишени, чтобы установить, какие аминокислотные остатки наиболее важны для функционирования белка и связывания лигандов. Эти сведения особенно ценны при оптимизации построенной модели, которая, будучи лишь производной от структуры белка-шаблона, не может учитывать всей биологической специфики моделируемого объекта.

Пространственное строение мишени может объяснить молекулярный механизм взаимодействия лиганда с белком, и используется в задачах молекулярного докинга — компьютерного моделирования взаимодействия белок-лиганд. Исходной информацией для докинга служат трёхмерные структуры белка (рецептора) и лиганда; конформационная подвижность и взаиморасположение с рецептором последнего моделируется в процессе докинга. Результатом моделирования является конформация лиганда, наилучшим образом взаимодействующая с белковым сайтом связывания — с точки зрения оценочной функции докинга, приближающей свободную энергию связывания лиганда. (Реально, в силу множества приближений, оценочные функции докинга далеко не всегда дают точную оценку экспериментальной энергией связывания.)

Докинг позволяет сократить затраты средств и времени за счет проведения процедуры, аналогичной высокопроизводительному скринингу, на компьютерных комплексах. Эта процедура называется виртуальным скринингом, и основным ее преимуществом является то, что в «реальных» фармакологических испытаниях нужно будет исследовать не целую библиотеку, состоящую из миллиона соединений, а только «виртуальные прототипы», идентифицированные на компьютере. Обычно же, с целью избежать ошибок, скрининг и докинг используются одновременно, взаимно дополняя друг друга (см. рис. 8).

Рисунок 8. Два варианта совместного использования высокопроизводительного скрининга и молекулярного моделирования. Сверху: последовательный итеративный скрининг. На каждом шаге процедуры используется сравнительно небольшой набор лигандов; по результатам скрининга строится модель, объясняющая связь между структурой и активностью. Модель используется для выбора следующего набора лигандов для тестирования. Снизу: «разовый» скрининг. На каждом шаге модель строится по обучающей выборке и используется для предсказаний на тестовой выборке.

С увеличением компьютерных мощностей и появлением физически более корректных и алгоритмов, докинг будет лучше оценивать энергию связывания белка с лигандом, начнет учитывать подвижность белковых цепей и влияние растворителя. Однако неизвестно, сможет ли виртуальный скрининг когда-нибудь полностью заменить реальный биохимический эксперимент; если да — то для этого, очевидно, необходим качественно новый уровень алгоритмов, неспособных на сегодняшний день абсолютно корректно описать взаимодействие лиганда с белком.

Одно из явлений, иллюстрирующих несовершенство алгоритмов докинга, — парадокс похожести. Этот парадокс заключается в том, что соединения, структурно совсем немного различающиеся, могут иметь драматически различную активность, и в то же время с точки зрения алгоритмов докинга быть практически неразличимыми.

Прототипы лекарства можно получать не только выбирая их из уже подготовленной базы данных соединений. Если есть структура мишени (или хотя бы трехмерная модель фармакофора), возможно построение лигандов de novo, используя общие принципы межмолекулярного взаимодействия. При этом подходе в сайт связывания лиганда помещается один или несколько базовых молекулярных фрагментов, и лиганд последовательно «наращивается» в сайте связывания, подвергаясь оптимизации на каждом шаге алгоритма. Полученные структуры, так же, как и при докинге, оцениваются с помощью эмпирических оценочных функций.

Ограничения применения компьютерных методов

Несмотря на всю свою перспективность, компьютерные методы имеют ряд ограничений, которые необходимо иметь в виду, чтобы правильно представлять себе их возможности.

Прежде всего, хотя идеология in silico подразумевает проведение полноценных компьютерных экспериментов, результаты которых ценны и достоверны сами по себе, необходима обязательная экспериментальная проверка полученных результатов. То есть, подразумевается тесное сотрудничество научных групп, проводящих компьютерный эксперимент, с другими экспериментальными группами.

Компьютерные методы не в силах учесть всего разнообразия влияния лекарственных препаратов на организм человека, поэтому использование компьютеров не способно ни упразднить, ни даже существенно сократить клиническое тестирование, занимающее основную долю времени в разработке нового препарата.

Таким образом, на сегодняшний день роль компьютерных методов в драг-дизайне сводится к ускорению и удешевлению исследований, предшествующих клиническим испытаниям.

Перспектива драг-дизайна

Направленный дизайн лекарственных и биологически активных соединений — это будущее фармацевтической промышленности. Современные биохимические и биофизические технологии уже сейчас стали важнейшей частью современного общества, позволяя победить многие болезни, излечение которых ранее не представлялось возможным. В перспективе, новые наукоемкие приложения смогут поднять драг-дизайн на еще более высокий уровень, когда будут, наконец, побеждены такие тяжелые заболевания, как рак, СПИД, болезнь Альцгеймера и другие недуги человечества.