ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ
Кафедра биологии имени академика Е.Н.Павловского
"УТВЕРЖДАЮ"
Заведующий кафедрой биологии
профессор
А.Ф.НИКИТИН
" "_________ 2013 г.
Доктор медицинских наук профессор
Никитин А.Ф.
Л Е К Ц И Я N 7
по биологии на тему
«РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕСИИ ГЕНОВ»
для курсантов и слушателей I курса 2 факультета
по специальности «Медико-профилактическое дело»
Обсуждена на заседании кафедры
" "___________________ 2013 г.
Протокол N__________________
САНКТ - ПЕТЕРБУРГ
2013 г.
С О Д Е Р Ж А Н И Е
ВВЕДЕНИЕ
Экспрессия генов — это процесс, в результате которого наследственная информация, заключенная в генах, преобразуется в молекулы РНК или белка. С функциональной активностью указанных молекул связаны все фундаментальные процессы жизнедеятельности клетки и организма: обмен веществ, транспорт, сигнализация, рост, воспроизведение и др. Поэтому исключительно большое значение для понимания адаптивных реакций клеток на изменения окружающей среды и интегрированности деятельности клеток в составе целостного организма приобретают знания механимов регуляции экспрессии генов у про и эукариот. Изучению этого вопроса и будет посвящена настоящая лекция.
На лекции будут рассмотрены следующие вопросы:
1. Общая характеристика регуляции экспрессии генов и ее биологическое значение;
2. Регуляция экспрессии генов у прокариот;
3. Регуляция экспрессии генов у эукариот
1 Экспрессия генов — это процесс, в результате которого наследственная информация, заключенная в генах, преобразуется в молекулы РНК или белка. С функциональной активностью этих молекул связаны все фундаментальные процессы жизнедеятельности клетки и организма: обмен веществ, транспорт, сигнализация, рост, воспроизведение и др.
Посредством контроля экспрессии генов про- и эукариотические организмы адаптируются к изменяющимся условиям окружающей среды. Отражением этого служит то, что лишь небольшая часть белков, которые закодированы в генах клетки или организма синтезируются ими в данное время. Например, в геноме кишечной палочки содержится более 4000 белок - кодирующих генов, однако в каждый данный момент в клетке синтезируется и активно функционирует не более 600-800 белков, необходимых ей для обеспечения жизнедеятельности в конкретных условиях. Остальные гены находятся в репрессированном, «выключенном» состоянии и их «включение» осуществляется лишь в ответ на изменения, возникающие в окружающей среде.
Механизмы регуляции экспрессии генов играют большую роль в процессах дифференциации и специализации клеток многоклеточных организмов в ходе их развития. Согласно современным представлениям, в основе указанных процессов лежит избирательная экспрессия генов в клетках, относящихся к разным типам. В результате, несмотря на наличие общей генетической программы и единого генома во всех клетках организма, каждый тип клеток характеризуется своим уникальным набором активно функционирующих белков и, как следствие этого, присущими только ему морфологическими и функциональными признаками. Например, в организме человека, состоящем более чем из 200 различных типов клеток, все клетки, за исключением лимфоцитов, имеют одинаковый геном, насчитывающий примерно 25000 генов. Однако в каждой отдельно взятой клетке лишь малая часть из них, примерно 20%, дерепрессированы и активно транскрибируются. Остальные гены находятся в неактивном репрессированном состоянии. При этом набор активно функционирующих генов в каждой конкретной клетке зависит от степение дифференцировки клетки, ее тканевой принадлежности и стадии жизненного цикла.
По функиональному признаку все гены многоклеточных организмов подразделяют на две группы: конститутивные гены или гены «домашнего хозяйства» (от англ. house keeping genes ) и регулируемые гены или гены «роскоши» (от англ.luxury genes).
Гены «домашнего хозяйства» составляют большую часть активно функционируюших генов организма. За редким исключением, они экспрессируются на всех стадиях жизненного цикла организма и обеспечивают синтез белков, необходимых для жизнедеятельности всех его клеток (рибосомные белки, ферменты гликолиза, ДНК- и РНК- полимеразы, тубулины, гистоны и др.).
Гены «роскоши» кодируют специфические белки и экспрессируются лишь в специализированных клетках. Они служат маркерами дифференцированных состояний. Некоторые их этих генов функционируют только на определенных стадиях эмбриогенеза. У человека к ним относятся, например, гены белка альфа- фетопротеина.. Экспрессия этих генов в клетках печени взрослого человека, свидетельствует о злокачественных новообразованиях в этом органе.
Впервые механизмы регуляции экспрессии генов были изучены у прокариот. И лишь в последние три десятилетия, на основе достижений молекулярной генетики удалось сформировать общие представления о механизмах регуляции экспрессии генов у эукариот.
2. У прокариот регуляция экспрессии генов осуществляется в основном на этапе транскрипции путем изменения эффективности связывания фермента РНК-полимеразы с последовательностями ДНК промоторов регулируемых генов. Большую роль в механизме регуляции активности генов играют особые гены-регуляторы, контролирующие синтез аллостерических регуляторных белков (белков-репрессоров и белков-активаторов), а также негенетические факторы–эффекторы, к которым относятся соединения небелковой природы- индукторы и корепрессоры (табл.1).
Таблица 1
Характеристика генетических и негенетических факторов регуляции экспрессии генов у прокариот
|
Названия регуляторных белков и эффекторов |
Точка приложения |
Функция |
|
Белки-репрессоры |
Присоединяются к оператору-регуляторной последовательности ДНК, расположенной между промотором ( частично перекрывают промотор) и генами оперона. |
Препятствуют соединению РНК - полимеразы с промотором и снижают уровень транскрипции генов оперона. Регуляция экспрессии генов на основе белков-репрессоров называется негативной, так как в ее основе лежит репрессия оперона регуляторным белком. |
|
Белки–активаторы (апоиндукторы) |
Присоединяются к активатору- регуляторной последовательности ДНК, предшествующей промотору и частично перекрывающей его |
Облегчают связывание РНК-полимеразы с промотором и стимулируют тем самым транскрипцию. Регуляция экспрессии генов на основе белков-активаторов называется позитивной. |
|
Индукторы
|
Связываются с активными белками - репрессорами и инактивируют их.
Связываются с неактивными белками -активаторами и активируют их. |
«Включают» транскрипцию генов. Регуляция экспрессии генов на основе белков-репрессоров и индукторов называется негативной индукцией. «Включают» транскрипцию генов. Регуляция экспрессии генов на основе белков-активатороов и индукторов называется позитивной индукцией.
|
|
Корепрессоры |
Связываются с неактивными белками репрессорами и активируют их.
Связываются с активными белками-активаторами и инактивируют их.
|
«Выключают» транскрипцию генов. Регуляция экспрессии генов на основе белков-репрессоров и корепрессоров называется негативной репрессией. «Выключают» транскрипцию генов. Регуляция экспрессии генов на основе белков-активаторов и корепрессоров называется позитивной репрессией.
|
В 1961 году французские ученые Ф. Жакоб и Ж. Моно предложили оперонную модель регуляции экспресиии прокариотических генов, объясняющую механизм контроля синтеза белков у прокариот путем «включения» и «выключения» тех или иных генов, в зависимости от потребности бактериальной клетки в метаболитах. Согласно этой модели структурные гены оперона, кодирующие белки, участвующие в одной цепи биохимическеих преобразований, располагаются рядом друг с другом и образуют единый функциональный блок. Все гены оперона имеют общие регуляторные элементы (промотор, оператор терминатор и др.) и транскрибируются, образуя одну полицистронную мРНК, с которой транслируются несколько разных полипептидов. Важное преимущесто, которое дает объединение разных генов в один оперон состоит в том, что это позволяет осуществлять координированный контроль экспрессии генов, путем одновременного их «включения» или «выключения». Например, при локализвации в одном опероне генов, кодирующих ферменты, катализирующие реакции одного катаболического пути, синтез каждого из них в ответ на появление соответствущего субтрата в окружающей среде осуществляется одновременно.
Классическим примером регуляции экспрессии генов у прокариот служит функционирование лактозного (lac) оперона кишечной палочки, в состав которого входят три структурных гена, кодирующих белки-ферменты, участвующие в усвоении лактозы: бета-галактозидазу, пермеазу и трансацетилазу, а также регуляторные последовательности для связывания белка репрессора и белка активатора (CRP-белка).
При выращивании E.coli на среде, содержащей только глюкозу ген- регулятор lac-оперона синтезирует активный белок-репрессор, который, взаимодействуя с оператором, «выключает» транскрипцию структурных генов, кодирующих ферменты, необходимые для усвоения лактозы. Если же клетки E.coli перенести на среду, содержащую только лактозу, то, проникая внутрь клеток, небольшая часть лактозы превращается в аллолактозу. Аллолактоза, связываясь с белком репрессором, инактивирует его. В результате РНК- полимераза осуществляет транскрипцию полицистронной мРНК для синтеза всех ферментов, необходимых для утилизации лактозы. В данном случае регуляция экспрессии генов оперона осуществляется на основе негативной индукции. При этом индуктором генов lac- оперона служит лактозы. Опероны, регулируемые подобным образом, получили название индуцибельных или индуцируемых оперонов
При культивировании кишечной палочки на среде, содержащей как лактозу, так и глюкозу бактерии утилизируют только глюкозу. Подобная избирательность в выборе субстрата обуславливается наличием у Е. соli механизма положительной регуляции активности генов lac- оперона. Роль активатора lac-оперона играет СRP –белок, который сам по себе неактивен и не может связываться с регуляторными последовательностями ДНК промотора. Эту способность СRP-белок приобретает лишь в комплексе с низко молекулярным соединением - циклическим аденозин монофосфатом (цАМФ), который накапливается в клетках кишечной палочки при отсутствии в культуральной среде, где они выращиваются, глюкозы.* Белок CRP в составе моплекса с цАМФ связывается с регуляторной последовательностью, примыкающей и частично перекрывающей промотор, и облегчает присоединение к нему РНК-полимеразы, стимулируя тем самым транскрипцию генов lac оперона. При наличии в среде глюкозы и лактозы СRP –белок остается неактивным и гены lac-оперона практически не транскрибируются. Это объясняется низким аффинитетом фермента РНК-полимеразы к промотору lac-оперона, и неспособностью указанного фермента связываться с промотором в отстутсвие активного активатора.
*Увеличение содержания цАМФ в клетках кишечной палочки при отсутствии в культуральной среде глюкозы объясняется о тем, что глюкоза инактивирует фермент аденилатциклазу, катализирующий образование цАМФ из АТФ, и активирует фермент фосфодиэстеразу, обеспечивающий превращение цАМФ в неактивный АМФ.
Двойной контроль экспрессии генов lac- оперона с участитем белка- репрессора и белка- активатора позволяет кишечной палочке не только быстро перестраивать свой метаболизм в изменяющихся условиях среды, поскольку содержимое кишечника человека, где эта бактерия обитает, характеризуется большим непостоянством, но и осуществлять биологически оправданный выбор субстрата для реакции брожения. Действительно, при наличии в среде глюкозы и лактозы, бактерии кишечной палочки усваивают только глюкозу, достигая этим наиболее экономного расходования имеющихся у них энергетических ресурсов. Объясняется это тем, что в отличие от глюкозы, использование в качестве энергетического субстрата лактозы, требует предварительного расщепления молочного сахара на глюкозу и галактозу, что сопряжено с дополнительными затратами энергии.
У кишечной палочки регуляция экспресси генов осуществляется не только на основе негативной индукции, но и посредством негативной репрессии. Примером такой регуляции служит функционирование триптофанового (trp) оперона, содержащего 5 структурных генов, кодирующих ферменты, необходимые для синтеза аминокислоты триптофана из ее предшественников .
При недостатке в клетке триптофана, белок-репрессор, оставаясь неактивным, не препятствует РНК- полимеразе присоединяться к промотору trp-оперона и транскрибировать полицистронную мРНК, кодидирующую ферменты, необходимые для синтеза этой аминокислоты из ее предшественников. При накоплении триптофана в клетке, указанная аминокислота связывается с белком-репрессором и, действуя как корепрессор, активирует его. Активированный белок-репрессор связывается с оператором и блокирует присоединение РНК- полимеразы к промотору. В результате trp-оперон «выключается» и синтез триптофана прекращается. Опероны, регулируемые подобным образом, получили название репрессибельных оперонов.
3. уляция экспрессии генов у эукариот осуществляется на предтранскрипционном этапе, в ходе транскрипции и на всех других этапах процесса реализации генетической информации, заключенной в гене: посттранскрипционном, трансляционном и посттрансляционном.
Большую роль в регуляции экспрессии генов на предтранскрипционном этапе играют процессы, связанные с изменениями структурной организации хроматина и степени cпирализации ДНК, которые во многом определяют возможность РНК полимеразы присоединяться к промотору гена и транскрибировать мРНК. Транскрипция эукариотических генов осуществляется лишь на нуклеосомном уровне организации хроматина, когда связь между ДНК и гистонами ослаблена, и становится невозможной при формировании элементарной хроматиновой фибриллы и других более высоких уровней компактизации хроматина. Поэтому эукариотические гены, локализующиеся в области гетерохроматина, не транскрибируются.
В настояшее время установлено, что структурная модификация хроматина тесно связана с химическими преобразованиями белков-гистонов, особенно их «хвостов», которые, располагаясь на поверхности нуклеосомы, оказываются доступными для действия различных ферментов. Например, присоединение ацетильных групп (- СОСН3) ферментом гистонацетилтрансферазой к остаткам лизина гистоновых «хвостов» приводит к декомпактизации хроматина, что облегчает инициацию транскрипции. Напротив, удаление ацетильных групп делает хроматин транкрипционно неактивным .
Эти, и многие другие данные, полученные в последние годы, позволили выдвинуть предположение о том, что экспрессия многих генов регулируется посредством так называемого «гистонового кода»: комбинации химических модификаций гистоновых «хвостов» хроматина, передающихся в ряду клеточных делений. От количества модификаций, их качественного состава и специфического набора в конечном итоге зависит экспрессия гена: быть ему активным или репрессированным. Считается, что «гистоновый код» представляет собой основной эпигенетический механизм, с помощью которого в клетках закодирована программа каскадного «включения – выключения» генов. Указанный код можно сравнить с матрицей, которая распознается регуляторными белками, модифицирующими структуру хроматина, разрыхляющими или, наоборот, уплотняющими его. Результатом этого является изменение экспрессии генов, расположенных в модифицированных участках хроматина
Большое значение в регуляции экспрессии генов на предтранскрипционном этапе имеют процессы, связанные с метилированием цитозиновых оснований ДНК с образованием метилцитозина. Указанная модификация копируется при удвоении ДНК и передается в ряду клеточных поколений. Объясняется это способностью молекулярных систем клетки распознавать метилированные цитозины на материнской цепи ДНК и присоединять метильные группы к таким же основаниям на вновь синтезируемой дочерней цепи. Метилирование цитозиновых оснований ДНК приводит к репрессии генов и служит одной из причин импринтинга.
На этапе транскрипции регуляция экспрессии генов у эукариот в общих чертах осуществляется также как у прокариот. Основное различие заключается в значительно большем количестве у эукариот, по сравнению с прокариотами, регуляторных последовательностей ДНК и регуляторных белков, контролирующих транскрипцию каждого гена. Фундаметальный принцип регуляция транскрипции генов эукариот заключается в том, что она является комбинационной. Это означает, что каждый эукариотический ген имеет свою специфическую комбинацию регуляторных последовательностей (контролирующих элементов), расположенных не только в непосредственной близости от промотора, но и находящихся на большом удалении от него, с которыми непосредственно связываются белки, регулирующие экспрессию гена.
В настоящее время у эукариот открыты сотни белков-активаторов и белков-репрессоров транскрипции, в строении которых имеются общие для всех них черты.
Указанные белки содержат в своем составе домен, посредством которого они непосредственно связываются с полинуклеотидными последовательностями контролирующих элементов, а также участки, предназначенные для взаимодействия с другими белками коактиваторами или общими транскрипционными факторами, участвующими в инициации транскрипции. Кроме того, многие регуляторные белки, активируют или ингибируют транскрипцию только в составе комплексов с другими белками. Все такие белки имеют домен димеризации, ответственный за формирование гомодимерных или гетеродимерных комплексов. Способность регуляторных белков образовывать гетеродимерные комплексы значительно увеличивает разнообразие специфических факторов транскрипции, что способствует более точной регуляции экспрессии эхуукариотических генов. Многие регуляторные белки проявляют свою биологическую активность только после их химической модификации, чаще всего в результате фосфорилирования в ответ на действие тех или иных сигналов. В структуре таких белков присутствуют специфические участки, подвергающиеся химическим изменениям.
Все белки-активаторы, участвущие в образовании комплекса инициирующего транскрипцию, действуют сходным образом: они связываются с другими регулятороными белками- коактиваторами, или общими транскрипционными факторами, или и с теми и с другими, что способствуют присоединению РНК-полимеразы к промотору и началу транскрипции. При этом значительное удаление энхансеров от промотора не препятствует участию связавшихся с энхансерами регуляторных белков–активаторов в инициации транскрипции. Согласно современным представлениям, присоединение белков–активаторов к контролирующим элементам энхансера вызывает белок опосредованный изгиб молекулы ДНК, благодаря чему белки-активаторы, несмотря на большую удаленность энхансера от промотора, получают возможность взаимодействовать в области промотора с другими белками, например, общими транскрипционными факторами, и усиливать транскрипцию .
Регуляторные белки, функционирующие как репрессоры, в отличие от белков-активаторов, ингибируют экспрессию генов несколькими способами.
Во-первых, белки репрессоры могут непосредственно присоединяться к контролирующим элементам ДНК энхансеров и, тем самым, блокировать присоединение к ним белков-активаторов. Во-вторых, они могут препятствовать взаимодействию в области промотора белков–активаторов с другими белками, способствующими образованию комплекса, инициирующего транскрипцию.
Специфическая комбинация контролирующих элементов, присущая каждому эукариотическому гену, служит основой координированной регуляции генов. Иными словами функционально связанные между собой гены эукариот имеют общие для них регуляторные последовательности-контролирующие элементы, с которыми связываются соответствующие специфические факторы транскрипции, благодаря чему достигается «включение» или «выключение» их в определенное время.
Регуляция экспрессии генов эукариот на посттранскрипционном этапе в процессе созревания пре-мРНК обеспечивается за счет альтернативного сплайсинга, в результате которого из одного и того же первичного транскрипта образуются разные молекулы зрелых мРНК и,как следствие этого, синтезируются разные белки. Показано, что альтернативный сплайсинг наблюдается в ходе экспрессии 94% генов человека. Экспрессии генов эукариот, благодаря наличию у них оформленного ядра, регулируется также в процессе транспорта зрелых мРНК из ядра в цитоплазму. Об этом убедительно свидетельствует то, что значительное количество вновь синтезированных молекул мРНК разрушается в ядре, и лишь небольшая часть их попадает в цитоплазму. На этапе трансляции регуляции экспрессии эукариотических генов осуществляется посредством контроля времени функционирования молекул мРНК и скорости трансляции белков на рибосомах.
Один из механизмов, контролирующих время функционирования эукариотических молекул мРНК, связан особенностями строения их регуляторных последовательностей, определяющих избирательное разрушение указанных мРНК под действием ферментов экзо- и эндонуклеаз. Например, чем длиннее поли-(А) фрагмент молекулы мРНК, тем больше время ее жизни. Существенно повышает чувствительность мРНК к расщеплению рибонуклеазами наличие в трейлерном участке этой молекулы АУУУА последовательностей или мотивов нестабильности. Например, показано, что перенос таких участков из короткоживушей мРНК фактора роста предшественникова эритроцитов в стабильные молекулы глобиновых мРНК вызывает быструю деградацию последних.
В клетках эукариот функционирует еще один механизм разрушения мРНК и блокады трансляции, связанный с недавно отрытыми молекулами микроРНК (миРНК) и маленьких интерфирирующих РНК (сиРНК), который получил название РНК интерференции, или РНК сайленсинга.
Гены миРНК и сиРНК обычно локализуются в неинформативных участках ДНК, расположенных между белок-кодирующими генами, а также в интронах, указанных генов. Поскольку молекуы миРНК и сиРНК выполняют сходные функции и отличаются лишь своим биогенезом механизмы РНК интерференции будут рассмотрены лишь на примере миРНК.
В процессе образования миРНК первонально транскрибируется относительно длинная молекула-предшественник миРНК, содержащая шпилькообразные структуры, цепи в которой соединены между собой водородными связями по принципу комплементарности. Затем каждая такая «шпилька» под действием одной из ядерных эндонуклеаз вырезается из молекулы-предшественника с образованием короткой двухцепочечной молекулы пре-миРНК длиной примерно 70 нуклеотидов с двумя свободными 5’- и 3’- концами. Молекулы пре- миРНК образуют комплекс с белком транспортином и в составе комплекса транспортируются из ядра в гиалоплазму. Здесь под действием специфической эндонуклеазы молекула пре-миРНК разрезается с образованием двухцепочечного фрагмента (дцРНК), состоящего из 20 пар нуклеотидов и содержащего по два неспаренных нуклеотида на 3’- конце. После чего указанный фрагмент дцРНК связывается с белками сообразованием комплеса, получившего название RISK (от англ. RNA induced silencing complex). В составе комплекса одна из цепей дцРНК разрушается, а другая приобретает способность связываться с комплементарными последовательностями молекул мРНК. Связывание миРНК с молекулой мРНК сопровождается либо разрушением молекулы мРНК, либо делает невозможным ее трансляцию. Считается, что посредством РНК интерференции регулируется экспрессия примерно одной трети всех генов человека.
Регуляция экспрессии эукариотических генов посредством контроля скорости синтеза белков на рибосомах обычно осуществляется на стадии инициации трансляции. Наиболее часто механизм такой регуляции связан с присоединением регуляторных белков к элементам вторичной структуры («шпилькам») молекулы мРНК, расположенным на их 5’- нетранслируемом участке. Это, в свою очередь, препятствует присоединению к мРНК малой субъединице рибосомы и вызывает блокаду трансляции. Примером такой регуляции экспрессии генов служит изменение скорости синтеза белка ферритина в ответ на колебания содержания свободных ионов железа в организме человека.
В механизме регуляции сакорости синтеза ферритина большую роль играет полинуклеотидная последовательность, образующая шпилечную структуру в 5'-нетранслируемом участке (лидере) ферритиновой мРНК. При низкой концентрации в клетке ионов железа с указанной последовательностью связывается регуляторный белок-аконитаза, препятствуя, таким образом, трансляции ферритиновой мРНК рибосомами. Если содержание ионов железа в организме увеличивается, то белок аконитаза, связывая ионы свободного железа, утрачивает свою способность присоединяться к ферритиновой мРНК. В результате скорость синтеза ферритина резко возрастает, что способствует связыванию свободных ионов железа белком ферритином .
Биологическпая целесообразность регуляции скорости синтеза ферритина ионами свободного железа, объясняется тем, что указанные ионы в свободном состоянии токсичны для организма человека и переводятся в нетоксичную форму при связывании их белком ферритином.