Методы исследования:

Вирусоскопия:

1. - Мазки отпечатки из мозга (аммонов рог, мозжечок);

- Гистологические срезы мозга головы;

2) – Оба препарата окрасить по Туревичу;

3) – Мазок из эмульсии загнивающего мозга окрашивают по Муромцеву;

4) – Мазок- отпечаток, обработанный ФИТЦ-антителами (антирабический лошадиный гамма- глобулин с изотиционатом-флюоресцеином);

5) - Микроскопия в МЛ-1, МЛ-2.x90,x10,x40, х7.

6) – Обнаружение телец Бабеш-Негри (красные), Муромцева (фиолетовые).

Вирусологические исследования:

1) – Внутримозговое заражение белых мышей (8-12 г веса).

2) – При наличии вируса мыши гибнут через 7-9 дней.

3) – Присутствие вируса у мышей подтверждают:

• Обнаружение телец Бабеша-Негри в мазках-отпечатках и срезах головного мозга;

• При иммуно-флюоресцентной обработке мазков-отпечатков ФИТЦ-препаратом;

• При постановке реакции нейтрализации: взвесь мозга погибших мышей соединяют с иммунной антирабической сывороткой на 1 час, а затем вводят в мозг новой партии мышей. Они должны остаться живыми;

4) Воспроизведение внутриклеточных телец Гварнери на роговице кроликов. Окраска по Романовскому-Гимзе.

Методы окраски мазков из разного материала.

1. Гистологические срезы мозга свежего трупа и окраска их по Туревичу.

   1. Железистый гемазоксимен Вейгерта – 1-2 мин.

   2. Смыть водой.

   3. 1% водный раствор

   4. Насыщенный водный раствор пикриновой кислоты с этанолом (1:1) – 10-20 мин.

Фиксация препаратов – в жидком фиксаторе.

Под микроскопом в нервных клетках – красные тельца Бабиш-Негри.

2. Мазки из эмульсии загнивающего мозга трупа и окраска их по

Муромцеву.

Гистологическая структура мозга нарушена. Готовят взвесь из ткани, а затем мазки. Фиксируют в жидком фиксаторе, затем красят.

1. Синька Мансона (метилен. синька – 2 г, бура – 3 г, дистиллированная вода – 100 мл) – 10 мин.

2. 10% водный раствор до появления голубого цвета.

3. Смыть водой.

Под микроскопом вишнёво-фиолетовые тельца на синем фоне.

Приложение 6

Схема лабораторной диагностики полиомиелита.

Материал исследования:отделяемое носоглотки, испражнения, спинномозговая жидкость, кал.

Методы исследования:

-вирусоскопический, - биологический,

-вирусологический, - серологический.

Вирусологическое исследование:

Готовят 10% взвесь испражнений в физиологическом растворе (0,9%), фильтруют, добавляют антибиотики.

1 день: Заражение нескольких типов клеточно-тканевых культур (выдерживать в термостате при +37^0С, 1-3 суток).

Заражение однодневных мышат. Наблюдение за их состоянием. При гибели – вскрытие.

3-7 дни: Доказательства присутствия вируса в заражённых объектах:

Цитопатогенное действие (ЦПД) энтеровирусного типа (округление клеток тканевого пласта).

Изучение патолого-анатомических изменений в органах.

7-8 дни: Идентификация выделенного вируса эталонными диагностическими сыворотками.

Реакция нейтрализации ЦПД, РИФ с типовыми сыворотками, РСК с культуральной жидкостью

Реакция нейтрализации вируса на мышах с типовыми сыворотками.

Заключение.

Приложение 7

Дополнение к диагностике полиомиелита в культуре ткани.

1. Для культивирования вирусов полиомиелита чаще используют:

• Первично трипсинизированные почки обезьяны,

• Первично трипсинизированные клетки почек эмбриона человека.

• Перевиваемые культуры клеток Нер-2, Детройт (первые-злокачественные клетки рака гортани человека).

О размножении вируса в культуре клеток свидетельствуют:

• ЦПД энтеровирусного типа (округление клеток).

• Отсутствие феномена гемадсорбции (вирусы полиомиелита не имеют антигена-гемагглютиногена),

• Отсутствие феномена гемагглютинации с культуральной жидкостью и взвесью эритроцитов,

• При прямой люминесцентной микроскопии клеточного пласта, обработанного только флюорохромом, включений вируса ни в протоплазме, ни в ядре обнаружить не удается.

- При иммунофлюоресцентном методе исследования –РИФ – то есть его комплексной обработке иммунной сывороткой с меченными антителами , вирусные включения хорошо видны.

2. цветная проба:

• В культуре ткани, не зараженной вирусом, под влиянием продуктов ее метаболизма рН среды меняется в кислую сторону. Поэтому и цвет индикатора (фенолрот) в питательной среде меняется с красного на желтый.

• В культуре клеток, зараженных вирусом, клетки гибнут, рН среды практически не меняется, цвет среды остается обычным - красным.

• Тип вируса устанавливают по реакции нейтрализации цветной пробы с помощью специфических антител иммунной сыворотки.

3. метод бляшек.

- Выращивают однослойную культуру клеток.

- Удаляют питательную среду (культуральный субстрат).

- Вносят вируссодержащий материал, встряхивают осторожно.

- Заливают инфицированный монослой клеток расплавленным агаром с индикатором (нейтральным красным), помещают в термостат на 24 – 72 часа.

- Там, где клетки растут, рН над ними изменяется в кислую сторону и среда, т. е. слой агара в этой зоне, становится розовым.

- Тип вируса устанавливают по реакции нейтрализации феномена бляшкообразования путём обработки вирусосодержащего материала специфической иммунной сывороткой.

Приложение 8