24) Получение трансгенных растений устойчивых к вредителям.

Получение из бактерий B.t. плазмиды 20.000 оборотов в минуту 4-6 часов + лизоцим( фермент класса гидролаз). В основе получения ГМО лежит получение рекомбинантной ДНК.

Рассмотрим пример получения рекомбинантной ДНК плазмиды кишечной палочки, синтезирующей человеческий инсулин

25.Получение трансгенных растений,устойчивых к гербицидам

Гербициды сплош-го действия + уничтож культ-х посеввоПлощадь этих ГМР составляет 80% от общей S в мире .Получают устойчивые ГМР путем пришив-я генов устойчивости бак и растит-го происхождения.

Из сорных выделен ген- pbcA, придающий уст к антрокнозу. Из кишечной палочки (E.coli) aroA раундап (глифосат-кислоты). Глифосат подавляет в клетках синтез ароматических аминокислот, обеспечивающих устойчивость к гербицидам 2,4-Д обеспечивает фермент монооксидазы. Получены устойчивые к гербицидам 20 сортов кукурузы, рис, хлопчатник, лен, томаты, земляника.

26.Этапы получения генномодифицированных растений. Векторы переноса генов в растения.

Получение б/т растений устойчивых этих ГМР составляет 80% в мире.

Получают устойчивые ГМР путем введения генов устойчивости бактериального и растительного происхождения.

Из сорняков путем обработки отразином – гербицин, выделен ген ДвсА.

Из клеток кишечной палочки выделен нег аroA к устойчивости раунтдап. Там действующее вещество называется глифосат кислота.

Глифосат подавляет в клетках синтез ароматических кислот. Они обеспечивают устойчивость к гербицидам 2,4 – Д, обеспечивают фермент монооксидазы (разрушает аминокислоты).

Получены к устойчивости к гербицидам 20 кукурузы, хлопчатник, соя, пшеница, картофель, лен, земляника, сахарная свекла…

Векторы переноса генов в растении

Векторы трансформации – перенос генов в клетки растений и их трансформация (встраивание в геном) осуществляется специфическими структурами векторов.

Вектор 1: биологическая биобалистика. Для однодольных растений применяют мелкие частицы вольфрама, платины, помещают в гены и за счет перепада давления эти частицы пролетают через клетки (3 мм размер).

Используют каусную ткань или клетки листьев – часть клеток погибнет, а выжившие культивируют до выживших растений.

Вектор 2: методы прямого переноса гена в клетки:

А) трансформация протопластов и их слияние

Б) используют микроиньекции ДНК. Эффективность 2%.

В) электропарация ДНК проник-т через поры в клетку под действием импульсов элек тока

Г) упаковка в липосомы

Вектор 3: векторы на основе Тi-плазмиды, agrobacterium, tumifaciens.

Агробактерия образует на корнях двудольных растений такие опухоли – корончатые галлы. Это вызывает бактериальный рак.

Эта бактерия имеет внехромосомную плазмиду, в которой находятся гены, образующие опухоль (Т-опухоль).

Vir-область (в ДНК раст-ой клетки, пришивает ген) → Ti-плазмида →Т-область: гармон независимости, образование опухоли, синтез своих белков, синтезирует опины (их типа).

Эта плазмида является естественным вектором трансформации для генов их преноса, включения и экспрессии генетической информации в растении.

После заражения, части плазмиды встречаются в хромосоме растений. Клетка изменяет метобализм, синтезирует опины. Опины - это продукты генов, которые бактерия вводит в растение.

Этот участок Тi-плазмиды называется Т-областью в бактерии т Т-ДНК в клетках растений. Т-область занимает примерно 10 % Тi-плазмиды и включает 4 гена. Гены, отвечающие за перенос и интеграцию генов Т-области находится не в ней самой, а рядом в Vir-области.

Гены: гармон независимости и гармон опухоли мешают получать растения.

Генетики из Т-области вырезают ненужные гены, пришивают на их место гены, которые надо пришить в растение.

Этот вектор применяют для двудольных. Полученный штам у агробактерий, у которых в Т-области помещены гены к устойчивости, к болезням, гербицидам, штамам.

Применяют еще другие агробактерии : agrobacterium rhizogenos.

Вектор 4: промежуточный и бинарный векторы.

Они сконструированы на основе Тi-плазмиды с помощью рестриктазы (днк) из Тi-плстиды, вырезают Т-область и встраивают в клетку кишечной палочки вырезают ее. Затем внутрь Т-области встраивают ген и вновь размножают.

Полученную рекомбинантную плазмиду вводят в агробактерию, несущую полную плазмиду.

В результате двойного крассинговера Т-область включается в Тi-плазмиду Аg завести в нормальную Т-область. Далее эти Аg используют для трансформации растений – это промежуточный вектор. Бинарный – это бактерии, содержащие 2 разные Тi-плазмиды. Одна несет Т-область с любыми генами, вторая vir- область обеспечивает помещение в геном растительной клетки.

Вектор 5: векторы на основе ДНК вирусов растений.

Таких вирусов всего 1-2%. Применяют вирус полосатости кукурузы и вирус мозайки цветной капусты.

В клетке растений образуется до 1000000 копий вируса (нуклеиновой кислоты).