Биотехнологии 2015 Сборник материалов международного конгресса

SECTION | | “BIOCATALYSIS AND BIOCATALYTIC TECHNOLOGIES”

особый интерес вызывает использование ферментов бактериофагов, разрушающих клеточную стенку бактерий. Обсуждены ферменты LysK бактериофага К, специфичного к стафилококку, и S 394/1, специфичного к сальмонелле и E. coli, их свойства, особенности лизиса патогенов, стабильность и возможности стабилизации с использованием полиэлектролитов. Возможности создания стабильных и эффективных средств борьбы с бактериальными инфекциями обсуждаются. Особенности строения клеточной стенки грамотрицательных бактерий диктуют, в частности, необходимость введения дополнительных хелперов для «разупорядочивания» внешней мембраны клетки. Один из разработанных подходов описывает введение дополнительных антибактериальных пептидов, помогающих работе антибактериального фермента. Другой подход заключается в использовании наночастиц магнетита в форме «палочек», сорбированных на клеточной стенке патогенов, «разупорядочивающих» под действием низкочастотного магнитного поля внешнюю мембрану патогенов и позволяющих антибактериальному ферменту с большей эффективностью разрушать пептидогликан клеточной стенки бактерий.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РНФ 14-13-00731 и K1-2014-022 (магнитные свойства наночастиц в форме «палочек»)

THEANTIBACTERIALENZYMESAND METHODS OF DELIVERY –ANALTERNATIVE TOANTIBIOTICS

N.L. Klyachko1,2, L.Yu. Filatova1, K.A. Miroshnikov3, S.A. Legotsky1,A.D. Priyma1, T.S. Belyy1,A. Usvaliev1, P.G. Rudakovskaya1, S.L. Gribanovsky5, E.A. Zaytseva1,A.B. Belova1,A.G. Majouga1,4, Yu.I. Golovin1,5,A.V. Kabanov1,6

1Lomonosov Moscow State University, Chemical Enzymology Department, Moscow 119991, Russia 2Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

3Shemyakin & Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Moscow, Russia 4National University of Science and Technology “MISIS” (MISIS), Moscow, Russia 5G.R. Derzhavin Tambov State University, Tambov, Russia

6University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA e-mail: [e-mail]

Enzymes of bacteriophages, specific towards staphylococci, Salmonella and E. coli, their properties, the lysis of pathogens, stability and the possibility of stabilization are discussed. Approaches have been developed to enhance the efficiency of bacteriolytic enzymes by “disordering” of outer membrane of the cell walls of Gram-negative bacteria.

Keywords: Staphylococcus aureus, Salmonella, E. coli, bacteriophage, antibacterial enzymes, pathogens lysis, antimicrobials, nanomaterials, drug delivery, magnetic nanoparticles, low-frequency magnetic field

A substantial number of pathogenic microorganisms resistant to small molecule antibiotics, caus- ing the need for new substances with antimicrobial activity, lacking the drawbacks of traditional anti- biotics. In particular, of particular interest is the use of bacteriophage enzymes that destroy bacterial cell wall. Enzymes LysK of bacteriophage K, specific towards staphylococci, and S 394/1, specificfor Salmonella and E. coli, their properties, especially the lysis of pathogens, stability and the possibil- ity of stabilization using polyelectrolytes are discussed. Possibilities of creating stable and effective enzyme preparations treating bacterial infections are discussed. Peculiarities of the structure of the cell wall of Gram-negative bacteria dictate, in particular, the need for additional helpers “disorder- ing” outer cell membrane. One of the approaches developed describes the introduction of additional

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	349

СЕКЦИЯ | | «БИОКАТАЛИЗ И БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ»

antimicrobial peptides, helping the antibacterial enzyme. Another approach is the use of magnetite nanoparticles in the form of “sticks”, adsorbed on the cell wall of pathogens, “disordering” under the effect of low-frequency magnetic fields the outer membrane of pathogens and allowing the antibacterial enzyme more efficiently destroy the peptidoglycan of bacterial cell wall.

The work was supported by grants RSF 14-13-00731 and K1-2014-022 (in part of magnetic measurements for nanoparticles in the form of “steaks”)

УДК 543.424.2;535.016

ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НАНОБИОМАТЕРИАЛОВ Курочкин И.Н.1, Рыжиков И.А.2, Сарычев А.К.2, Афанасьев К.Н.2, Будашов И.А.1, Еременко А.В.1, Сиголаева Л.В.1, Седова М.В.2, Богинская И.А.2, Амитонов С.В.1, Коростылев Е.В.,2 Лагарьков А.Н.2

1Химический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова,

Москва, e-mail: [e-mail]

2Институт теоретической и прикладной электродинамики РАН,

Москва, e-mail: [e-mail], [e-mail]

Рассматриваются вопросы использования новых метаматериалов и белок полимерных покрытий для создания оптических и электрохимических сенсоров

Ключевые слова: гигантское комбинационное рассеяние, метаматериалы, полиэлектролиты, слой за слоем, биосенсоры, иммуноанализ, амперометрические сенсоры.

Исследованы возможности использования нового диэлектрического метаматериала, содержащего диэлектрические и плазмонные резонаторы для целей дополнительного усиления сигнала гигантского комбинационного рассеяния и создания нового поколения сенсорных материалов. Созданный метаматериал включает в свой состав пленки диоксида церия и иммобилизованные на их поверхности плазмонные наночастицы. Достигнуто дополнительное усиление сигнала гигантского комбинационного рассеяния более чем в 200 раз. Рассмотрены вопросы применения нового материала для высокочувствительного биохимического и иммунологического анализов.

Показаны возможности использования наноразмерных частиц диоксида марганца и фер- мент-полиэлектролитных комплексов для создания высокочувствительных амперометрических сенсоров для определения нейротоксинов и эстераз крови.

УДК 543.424.2;535.016

HIGHLY SENSITIVE SENSORS BASED ON NANOBIOMATERIALS

Kurochkin I.N.1, Ryzhikov I.A.2, SarychevA.K.2,Afanasiev K.N.2, Budashov I.A.1, EremenkoA.V.1,

Sigolaeva L.V.1, Sedova M.V.2, Boginskaya I.A.2,Amitonov S.V.3, Korostilev E.V.2, LagarkovA.N.2

1Faculty of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow,

2Institute for Theoretical and Applied Electromagnetics, The Russian Academy of Science, Moscow

The presentation deals with the use of new metamaterials and protein polymer coatings to create

optical and electrochemical sensors

Keywords: enhanced Raman scattering, metamaterials, polyelectrolytes, layer by layer, biosen- sors, immunoassays, amperometric sensors.

350	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOCATALYSIS AND BIOCATALYTIC TECHNOLOGIES”

The presentation considers the possibility of the facet structures, based on cerium dioxide for the purpose of increasing the intensity of the SERS signal. During the studies a new metamaterial was developed. The metamaterial is based on the facet cerium dioxide films and plasmonic nanoparticles that are immobilized on its surface. The new metamaterial provides additional SERS signal amplification factor more than 200. Thus developed material offers the prospect of increasing the sensitivity and selectivity of biochemical and immunological analysis.

The presentation also shows the possibility of using nano-sized particles of manganese dioxide and the enzyme-polyelectrolyte complexes for the development of highly sensitive amperometric sensors for the detection of neurotoxins and blood esterases.

УДК 577.154.2 + 542.952+ 579.22; 577.152.1

ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ПЕРЕЭТЕРИФИКАЦИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ В ЦЕННЫЕ МАСЛОЖИРОВЫЕ ПРОДУКТЫ И БИОДИЗЕЛЬ Коваленко Г.А.1,2, Перминова Л.В.1, Беклемишев А.Б.1, Кузнецов В.Л.1,2

1Институт катализа СО РАН им. Г.К. Борескова, Новосибирск, Россия 630090, Новосибирск, пр. Акад. Лаврентьева, 5 2Новосибирский государственный Университет, Новосибирск, Россия e-mail: [e-mail]

Гетерогенные биокатализаторы приготовлены путем включения клеточных лизатов рекомбинантного штамма rE.сoli/lip, продуцирующего термостабильную липазу из Thermomyces lanuginosus, в наноуглерод-силикатные ксерогели. Свойства приготовленных биокатализаторов исследованы в процессах переэтерификации триглицеридов растительных масел, в том числе, в биодизель.

Ключевые слова: рекомбинантная липаза, клеточные лизаты, гетерогенные биокатализаторы, переэтерификация триглицеридов

Проведенысравнительныеисследованиягетерогенныхбиокатализаторовс активностьютермостабильной липазы, приготовленных путем включения клеточных лизатов рекомбинантного штамма-продуцента rE.сoli/lip в композитные наноуглерод-силикатные ксерогели. Свойства биокатализаторов (ферментативная активность и операционная стабильность) изучены в процессах переэтерификации триглицеридов в масложировых смесях, а также с участием тетилили этил-ацетата в эфиры жирных кислот (биодизель).

При исследовании многокомпонентных биокатализаторов было обнаружено, что наноструктурированные формы углерода, вводимые в SiO2-ксерогель одновременно с липазой rE.сoli/lip, влияют на увеличение начальной конверсии (х) в реакции переэтерификации масложировых смесей при 70–75°С следующим образом: без наноуглерода (х = 41%) > агрегаты углеродных нанотрубок (УНТ)

(х = 35%) > диспергированные УНТ (х = 26%) > «нано-лук» (х = 20%), что объясняется осо- бенностями механизма биокатализа липазой и гидрофобно-гидрофильными взаимодействиями фермента с наноуглеродным компонентом.

При изучении периодического процесса переэтерификации растительного (подсолнечного) масла с участием метилили этилацетата при 40°С было обнаружено, что биокатализаторы ста- бильно работают в течение >1 000 часов.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	351

СЕКЦИЯ | | «БИОКАТАЛИЗ И БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ»

УДК 577.154.2 + 542.952+ 579.22; 577.152.1

HETEROGENEOUS BIOCATALYSTS FOR THE CONVERSION OFVEGETABLE OILS INTO VALUABLE PRODUCTS OFTRIGLYCEFIDERS’INTERESTERIFICATION SUCHAS OILFAT BLENDSAND BIODIESEL

Kovalenko G.A., Perminova L.V., BeklemishevA.B., Kuznetsov V.L.

Boreskov Institute of Catalysis, Novosibirsk, Russia 630090, Novosibirsk, Av. Akad. Lavrentyeva, 5 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia e-mail: [e-mail]

Heterogeneous biocatalysts were prepared by entrapment of cells’ lysates of recombinant strain rE.сoli/lip producing thermostable lipase of Thermomyces lanuginosus inside nanocarbon-in-SiO2- xerogel composites. Properties of the biocatalysts were studied in the reactions of triglycerides’interesterification, in particular with participation of methylor ethyl-acetate to biodiesel.

Keywords: thermostable lipase, heterogeneous biocatalysts, triglycerides’ interesterification

Comparative investigations of the heterogeneous biocatalysts with activity of thermostable lipase are carried out. The biocatalysts are prepared by entrapment of cells’ lysates of recombinant strain rE.сoli/lip producing thermostable lipase of Thermomyces lanuginosus inside nanocarbon-in-SiO2- xerogel composites. Properties of the biocatalysts such as enzymatic activity and operational stability are studied in the reactions of triglycerides’ interesterification in vegetable oil-fat blends, as well as reactions with participation of methylor ethyl-acetate for production of the esters of fatty acids (biodiesel).

The study on the effect of the nanostructured carbon fine powders (carbon nanotubes CNTs and onion-like nanospheres) included inside silica xerogel on the biocatalysts’ initial activity expressed as substrate’ conversion is carried out in the periodic process of interesterification of oil-fat blends at 70–70°С. Because of enhancement of the conversion (x) the included nanocarbons can be arranged in the following order: no nanocarbon (х = 41%) > aggregated CNTs (х = 35%) > dispersed CNTs (х = 26% ) > “nano-onion” (х = 20%).

It is found that prepared multicomponent biocatalysts operate in the periodic process of interesterification of sun flower oil with participation of methylor ethyl-acetate into biodiesel for more than 1000 h at 40°С.

УДК 577.15.08

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ ЦИТОХРОМА Р450 17А1 ДЛЯ СКРИНИНГА НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ – ОКСАЗОЛИН-СОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ 17(20) Е-ПРЕГНА-5,17(20)-ДИЕНА

Кузиков А.В., Стулов С.В., Шумянцева В.В., Мишарин А.Ю., Арчаков А.И.

Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский

институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича».

[e-mail],

8  [phone] 119121, г. Москва, Погодинская ул. д. 10, стр.7

ЦитохромыР450(CYP)являютсябелками-мишенямиприразработкеновыхпротивораковых препаратов в случае гормон-зависимых онкологических заболеваний. Ингибиторы ключево-

352 Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOCATALYSIS AND BIOCATALYTIC TECHNOLOGIES”

го фермента синтеза андрогенов – CYP17А1, катализирующего 17α-гидроксилазную-17,20- лиазную реакцию, используются при лечении андроген-зависимого рака простаты. Анализ каталитической активности цитохромов Р450 требует присутствия белков редокс-партнеров и доноров электронов (NADPH).Электрохимическиецитохром Р450–системы, в которых электрод играет роль донора электронов, позволяют исследовать субстрат-ингибиторный потенциал Р450 с высокой чувствительностью, а также рассчитывать электрокинетические параметры ферментативных реакций.

В работе с помощью электрохимических методованализа – циклической вольтамперометрии и амперометриипри контролируемом напряжении на модифицированных дидодецилдиметиламмоний бромидом печатных графитовых электродах с иммобилизованным цитохромом Р450 17А1 (10-12моль белка/электрод), проведеноисследование новыхоксазолин-содержащих производных 17(20)Е-прегна-5,17(20)-диена, полученных в лаборатории синтеза физиологически активных соединений ИБМХ. Среди новых оксазолин-содержащих производных 17(20) Е-прегна-5,17(20)-диенанайдены соединения – потенциальные ингибиторы Р450 17А1 по отношению к субстрату – прегненолону.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 14-04-91337).

ELECTROCHEMICALBIOSENSORS BASED ON CYTOCHROME P450 17A1 FOR SCREENING OF NEW INHIBITORS – OXAZOLINE-CONTAINING DERIVATIVES 17(20) E-PREGNA-5,17(20)-DIENE

KuzikovA.V., Stulov S.V., Shumyantseva V.V., MisharinA.Y.,ArchakovA.I.

Institute of Biomedical Chemistry of the RAMS, Moscow, Russia

Cytochromes P450 (CYP) are the target proteins in the development of new anti-cancer drugs in the case of hormone-dependent tumors. Inhibitors of CYP17A1, a key enzyme in the synthesis of androgen, which catalyze 17α-hydroxylase 17,20-lyase reactions, are used in the treatment of an- drogen-dependent prostate cancer. Analysis of the catalytic activity of the cytochrome P450 proteins requires the presence ofprotein redox partners and an electron donor (e. g. NADPH). Electrochemical cytochrome P450 systems, where electrode serves as an electron donor, allow to investigate the sub- strate-inhibitory potential of the P450 with high sensitivity and to calculate the parameters of electro kinetic enzymatic reactions.

New oxazoline-containing derivatives of 17(20)E-pregna-5,17(20)-diene obtained in the laboratory of synthesis of physiologically active compounds of IBMC were studied by means of electrochemical methods such as cyclic voltammetry and amperometry at a controlled potential. Screen printed graphite electrodes modified with didodecyldimethylammonium bromide/cytochrome P450 17A1 (10-12mole protein/electrode) were used as sensing elements of electro analysis. Based on analy- sis of electrochemical parameters, potential inhibitors of P450 17A1 were found among the new oxazoline-containing derivatives 17(20)E-pregna-5,17(20)-diene, when pregnenolone was used as substrate of this enzyme.

This work has been supported by the Russian Foundation for Basic Research (RFBR grant № 14- 04-91337).

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	353

СЕКЦИЯ | | «БИОКАТАЛИЗ И БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ»

УДК 577.112.824: 615.9

ЭСТЕРАЗНЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗА ДЕЙСТВИЯ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ИНТОКСИКАНТОВ Махаева Г.Ф.

Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка, Россия 142432, г. Черноголовка, Московской обл., Северный проезд, 1

e-mail: [e-mail]

Обсуждается эстеразный статус организма как эффективный и информативный биомаркер интоксикаций фосфорорганическими соединениями

Ключевые слова: фосфорорганические соединения; эстеразный статус; эстеразы крови; биомаркеры.

Разработка биомаркеров воздействия фосфорорганических соединений (ФОС) на человека и их количественная оценка (квантификация) является важнейшим компонентом системы предсказания и ранней диагностики вызываемых ими заболеваний. Нами была предложена концеп - ция «эстеразного статуса» организма как совокупности активностей эстераз крови, с которыми взаимодействуют ФОС. Это ацетилхолинэстераза (АХЭ), бутирилхолинэстераза (БХЭ), нейротоксичная эстераза (НТЭ), карбоксилэстераза (КЭ), параоксоназа (PON1). Эстеразный статус определяет в значительной степени индивидуальную чувствительность организма к ФОС и другим антихолинэстеразным соединениям и может быть использован в качестве комплексного биомаркера воздействия таких соединений. Мы полагаем, что этот комплексный биомаркер является более эффективным и информативным по сравнению с стандартным определением активностей отдельных ферментов – БХЭ плазмы, АХЭ эритроцитов и НТЭ лимфоцитов, поскольку оценка эстеразного статуса позволит сразу определить: 1) подвергался ли человек вообще воздействию ФОС, 2) оценить характер воздействия – дискриминировать острую и отставленную нейротоксичность, 3) оценить степень воздействия, что важно для последующей терапии. Проведенные эксперименты на грызунах показали, что определение эстеразного статуса позволяет улучшить возможности корректной диагностики отравлений и прогноза развития интоксикаций, вызываемых ФОС. Обсуждаются методы оценки эстеразного статуса и различные аспекты его применения для биомедицинской диагностики.

Литература

1.  Makhaeva G.F., Rudakova E.V., Boltneva N.P., Sigolaeva L.V., EremenkoA.V., Kurochkin I.N., Richardson R.J.Blood Esterases as a Complex Biomarker for Exposure to Organophosphorus Compounds. In: Counteraction to Chemical and Biological Terrorism in the East Europe Countries, Eds C. Dishovsky, A. Pivovarov, Springer, 2009, pp. 177–194.

2.  Makhaeva G.F., Rudakova E.V., Sigolaeva L.V.Investigation of esterase status as a complex

biomarker of exposure to organophosphorus compounds. In: Toxicological Problems, Ch. Dishovsky,

J. Radenkova-Saeva Eds., Military Publishing Ltd., Sofia, 2014, pp.15–26.

3.  Boltneva N.P., Rudakova E.V., Sigolaeva L.V., Makhaeva G.F.Esterase Status of Various

Species in Assessment of Exposure to Organophosphorus Compounds. In: Toxicological Problems, Ch. Dishovsky, J. Radenkova-Saeva Eds., Military Publishing Ltd., Sofia, 2014, pp. 27-38.

354	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOCATALYSIS AND BIOCATALYTIC TECHNOLOGIES”

УДК 577.112.824: 615.9

ESTERASE STATUS OF ORGANISM FOR DIAGNOSTICSAND PROGNOSIS OFACTION OF ORGANOPHOSPHORUS TOXICANTS

Makhaeva G.F.

Institute of Physiologically Active Compounds Russian Academy of Sciences, Chernogolovka, Russia 142432, Chernogolovka, Moscow Region, Severny Proezd, 1

e-mail: [e-mail]

Esterase status of an organism as the effective and informative biomarker of intoxications with organophosphorus compounds is discussed.

Key words: фосфорорганические соединения; эстеразный статус; эстеразы крови; биомарке-

ры. organophosphorus compounds; esterase status; blood esterases; biomarkers

Development of biomarkers of human exposures to OPCs and their quantification is a vital component of a system of prediction and early diagnostics of the induced diseases. We proposed to use the conception of organism “esterase status” as a set of blood esterases to which OPC interact: acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE), neuropathy target esterase (NTE), carboxylesterase (CaE) and paraoxonase (PON1). Esterase status determines in a great extent the individual sensitivity to OPCs and other anticholinesterase compounds and can be used as a complex biomarker of exposure. We suggest that this complex biomarker should be more effective and informative than standard assays of plasma BChE, RBC AChE, and lymphocyte NTE. It will allow us: 1) to assess an exposure as such and to confirm the nonexposure of individuals suspected to have been exposed; 2) to determine if the exposure was to agents expected to produce acute and/or delayed neurotoxicity; 3) to perform dosimetryof the exposure, which provides valuable informationfor medical treatment.The performed experiments on mice demonstrated that determination of the esterase status of an organism allows one to improve the possibilities of diagnosis and prognosis of intoxications development. The methods of esterase status determination are discussed as well various aspects of its application for biomedical diagnostics.

References

4.  Makhaeva G.F., Rudakova E.V., Boltneva N.P., Sigolaeva L.V., EremenkoA.V., Kurochkin I.N., Richardson R.J.Blood Esterases as a Complex Biomarker for Exposure to Organophosphorus Compounds. In: Counteraction to Chemical and Biological Terrorism in the East Europe Countries, Eds C. Dishovsky, A. Pivovarov, Springer, 2009, pp. 177–194.

5.  Makhaeva G.F., Rudakova E.V., Sigolaeva L.V.Investigation of esterase status as a complex biomarker of exposure to organophosphorus compounds. In: Toxicological Problems, Ch. Dishovsky, J. Radenkova-Saeva Eds., Military Publishing Ltd., Sofia, 2014, pp.15–26.

6.  Boltneva N.P., Rudakova E.V., Sigolaeva L.V., Makhaeva G.F.Esterase Status of Various Species in Assessment of Exposure to Organophosphorus Compounds. In: Toxicological Problems, Ch. Dishovsky, J. Radenkova-Saeva Eds., Military Publishing Ltd., Sofia, 2014, pp. 27-38.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	355

СЕКЦИЯ | | «БИОКАТАЛИЗ И БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ»

УДК – 577.15.08

ИЗУЧЕНИЕ КСИЛАНОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

GEOBACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS 22 VKPMB-11678 (ГОРЯЧИЙИ СТОЧНИК ГАРГА,

РОССИЯ)

РозановА.С.*, Сушенцева Н.Н., Малуп Т.К., Горячковская Т.Н., Демидова Е.В.,

Мещерякова И.А., Демидов Е.А., Пельтек С.Е.

Институт Цитологии и Генетики СО РАН, Новосибирск, Россиия 630090  Новосибирск, проспект Лаврентьева 10

*e-mail: [e-mail].

Были выделены термофильные ферменты из генома Geobacillusstearothermophilus 22 VKPMB-11678, разрушающие гемицеллюлозные связи, и определены их свойства.

Ключевые слова: Geobacillusstearothermophilus, ксиланаза, ионнаяжидкость

Цель нашей работы, изучение гидролитических свойств ферментов гемицеллюлазногоко мплекса Geobacillusstearothermophilus 22 VKPMB-11678, выделенного из донных отложений горячего источника Гаргинский, долина реки Баргузин, Прибайкалье, Россия, и проверка их активности в присутствии ионных жидкостей. В экспрессирующие конструкции были клони-

рованы гены ферментов: α-glucuronidase, endo-1,4-β-xylanase, xylan-1,4-β-xylosidase, andα-L- arabinofuranosidase. Энзиматические свойства ферментов были изучены при разных pH (4–8) и температурах (45–70°C).Для части ферментов были изучены их свойства в присутствии ионных жидкостей. Эта характеристика важна так как применение ионных жидкостей имеют значи - тельный потенциал для переработки растительной биомассы.

Воздействие ионных жидкостей на ферменты разнонаправленное. Ферментативныя активность xylan-1,4-β-xylosidase возрастает в присутствии ионных жидкостей при их концентрации 5 и 10%, Рисунок 1. В то время как ферментативная активность endo-1,4-β-xylanase радикально уменьшаетсяприконцентрацииионнойжидкости5%.Этоможетбытьвызванокакзакислением среды в присутствии ионной жидкости, endo-1,4-β-xylanaseдемонстрирует низкую активность при низких значенияхpH. В то время как, на повышение активности xylan-1,4-β-xylosidase могло повлиять повышение доступности субстрат и возможно изменение свойств фермента.

Рисунок 1. Относительная активность белка при разных концентрация ионной жидкости. За 100% взята активность при отсутствии ионных жидкостей в ферментативной реакции.

356	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015

SECTION | | “BIOCATALYSIS AND BIOCATALYTIC TECHNOLOGIES”

577.15.08

RESEARCH OF XYLANOLITIK PROTEINS FROM GEOBACILLUSSTEAROTHERMOPHILUS22 VKPM B-11678 (GARGAHOT SPRING, RUSSIA)

RozanovAleksei S.*, Sushentseva Natalya N., Malup Tatiana K., Goryachkovskaya Tatiana N.,

Demidova Elisaveta V., Meshcheriakova IrinaA., Demidov EvgeniyA., Peltek Sergey E.

Institute of Cytology & Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Science, Ave. Lavrentieva 10, Novosibirsk, Russia

*e-mail: [e-mail].

Thermophilichemicellulose disrupting enzymes have been isolated from the genome of Geobacill usstearothermophilus 22 VKPM B-11678, and determine their properties.

Keywords: Geobacillusstearothermophilus, xylanase, ionic liquid

The aim of this work was to study the hemicellulose complex proteins of Geobacillusstearother mophilus22 VKPM B-11678, isolated from sediment from Garga Hot Spring, Barguzin River Valley, Baikal, Russia, for plant biomass hydrolysis, and examine their activity under highly ionic conditions. Genes encoding several thermophilicxylanases were cloned, including α-glucuronidase, endo- 1,4-β-xylanase, xylan-1,4-β-xylosidase, and α-L-arabinofuranosidase. The enzymatic activities of the proteins were studied under a wide range of pH (4–8) and temperature (45–70°C) conditions. The enzymatic activitiesin ionic liquids demonstrating for two proteins were studied. This characteristic is important because the use of ionic liquids is a promising method for pretreatment of lignocellulosic biomass.

The influence of ionic liquids on enzyme activity was multidirectional. The enzymatic activity of xylan-1,4-β-xylosidase increased at ionic liquid concentrations of 5 and 10%, Figure 1. However, the enzymatic activity of endo-1,4-β-xylanase decreased in the presence of ionic liquid, even at a concentration of 5%. This may be a result of the acidification of the ionic liquid, particularly as endo- 1,4-β-xylanasedemonstrated low activity at acidic pH. The reason for the high efficiency of the enzyme complex is that endo-1,4-β-xylanase significantly improves the availability of hemicellulose for xylan-1,4-β-xylosidase by eliminating hemicellulose at relatively short soluble xylooligosaccharides.

Congress “BIOTECHNOLOGY: STATE OF THE ART AND PROSPECTS OF DEVELOPMENT” March 17-20, 2015	357

СЕКЦИЯ | | «БИОКАТАЛИЗ И БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ»

УДК 543.9

МОНО И БИФЕРМЕНТНЫЕ БИОСЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ СТИМУЛЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ МИКРОГЕЛЕЙ Сиголаева Л.В.1, Гладыр С.Ю.1, Евтушенко Е.Г.1, Гелиссен А.П.Х.2, Мергель О.2,

Пергушов Д.В.1, Курочкин И.Н.1, Плампер Ф.А.2, Рихтеринг В.2

1Химический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Ленинские горы, 1/3, Москва, 119991, Россия

2Институт физической химии II, Рейнско-Вестфальская высшая техническая школа, Университет

г. Аахена, Аахен, D-52056, Германия e-mail: [e-mail]

Исследованы свойства моно и биферментных биосенсорных систем, сформированных в различных температурных и рН условиях путем взаимодействия биомолекул со стимул-чувстви- тельным микрогелем, адсорбированным на проводящие поверхности.

Ключевые слова: катионный полимерный микрогель, стимул-чувствительный полимер, модификация поверхности, тирозиназа, холиноксидаза, бутирилхолинэстераза, биосенсор.

В работе исследованы способы формирования и свойства микрогель/ферментных тонких пленок нанесенных в различных температурных и рН-условиях на проводящие субстраты методом последовательной двух-стадийной адсорбции температуро-и рН-чувствительного микрогеля поли(N-изопропилакриламид-co-3-(N,N,-диметиламино)пропилметакриламида) (поли(НИПАМ-co-ДМАПМА), с последующей адсорбцией ферментов (тирозиназы, холиноксидазы и/или бутирилхолинэстеразы). При помощи (i) усиленной адсорбции поли(НИПАМ- co-ДМАПМА микрогеля при T>VPTT (температуры фазового перехода, сопровождающегося изменением объема) и (ii) последующей адсорбции фермента по принципу всасывания губкой при T<VPTT, можно достичь значительного увеличения чувствительности биосенсоров для анализа фенола (в случае иммобилизованной тирозиназы) или холина (в случае иммобилизованной холиноксидазы). Данный способ адсорбции ферментов зависит от размера белковой глобулы и позволяет в одну стадию получить биферментные системы с пространственно разделенными иммобилизованными ферментами, что показано на примере биферментной системы холиноксидаза/бутирилхолинэстераза.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ 14-08-01108 и DFG в рамках SFB 985.

358	Конгресс «БИОТЕХНОЛОГИЯ: СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ» 17-20 марта 2015