Тема 4. Ферменти. Ферментативна (каталітична) функція білків

ПЛАН:

1. Біологічний каталіз. Методи біологічної хімії, які використовуються для виділення і очищення ферментів.

2. Властивості ферментів.

3. Принципи і сучасний стан класифікації ферментів. Сучасний стан класифікації ферментів.

4. Локалізація ферментів в клітині.

5. Промислове виготовлення і практичне використання ферментів.

ЛІТЕРАТУРА:

1. Конильчук Г.Н. Біохімія. Підручник для студентів спеціальності „Фізкультура”. Х., 2004 рік

2. Явоненко А.Ф. Біохімія людини. К.:Знання, 2001 рік

3. Фримантл М. Химия в действии. М.: Мир, 1991 год

Вимоги до знань та вмінь студентів

По завершенні вивчення теми студенти повинні знати:

• поняття про біологічни каталіз;

• роль ферментів у процесах життєдіяльності;

• будову ферментів;

• механізм дії ферментів

• основні властивості ферментів

• принципи та сучасний стан класифікації ферментів;

• основні класи ферментів;

• локалізацію ферментів у клітині живого організму;

• методи промислового виготовлення ферментів і галузі їх практичного застосування

і повинні вміти:

• записувати будову ферментів;

• пояснювати механізм біологічного каталізу та специфічність ферментів

• пояснювати властивості ферментів з огляду на їх білкову природу;

• володіти основними методиками вивчення ферментів у процесі біохімічного дослідження організмів (якісне визначення ферментів та їх дії).

• називати найважливіші з вивчених ферментів, вказувати їх клас;

володіти основними методиками вивчення ферментів у процесі біохімічного дослідження організмів (кількісне визначення активності ферментів

1. Уявлення про те, що обмін речовин у всіх живих організмів здійснюється за допомогою ферментів, або ензимів - специфічних органічних каталізаторів, що синтезуються живими клітинами, - формувалось поступово, починаючи з 1815 р., коли Кірхгоф отримав з пшениці екстракт, здатний перетворювати крохмаль на цукор.

Довготривала суперечка між Лібіхом і Пастером про те, чи можна вважати живими самі ферменти, знайшла розв’язку на користь Лібіха в 1897 р., коли Едуард Бухнер приготував з дріжжів безклітинний екстракт, що перетворював цукор на спирт. В результаті інтенсивних ензимологічних досліджень вдалося виділити велику кількість ферментів, довести, що всі вони являють собою макромолекули білкової природи і що кожен фермент регулює певну хімічну реакцію завдяки специфічній конфігурації своєї молекули. Речовина, з якою відбувається хімічна реакція (субстрат), з’єднується з ферментом, утворюючи з ним специфічний комплекс (далі: ФСК – ферметно-субстрактний комплекс). Таким чином, ферменти регулюють швидкість і специфічність практично всіх хімічних реакцій, що протікають в живих організмах.

Робота ферментів відбувається впорядковано, серіями етапів, що називаються метаболічними шляхами. Тому хімічні процеси в живих організмах проходять з дивовижною ефективністю. По-перше, непотрібних продуктів реакцій накопичується дуже мало, оскільки кожен продукт однієї реакції виступає в ролі субстрату для наступної і т.д. Друга перевага послідовного ходу реакцій стає зрозумілою, якщо врахувати, що хімічні реакції можуть протікати в будь-якому напрямку, тобто вони є оберненими. Якщо кожен продукт окремої реакції в процесі утворення одразу вступає в іншу реакцію, то тенденція до оберненості зводиться до мінімуму. Більше того: якщо можливий кінцевий метаболіт також буде використовуватись швидко, то ціла серія реакцій буде рухатись до завершення. Інша перевага полягає в тому, що групи ферментів, що беруть участь в загальних метаболічних шляхах, можуть об’єднуватись. Деякі було виявлено в невеличких везикулах (мембранних пухирцях) в цитоплазмі. Інші зв’язані з мембранами спеціалізованих органел, таких, як мітохондрії або хлоропласти.

Одним з важливих напрямків біотехнології мікроорганізмів є використання продуктів їх життєдіяльності. Продукти життєдіяльності за природою і за призначенням можна розділити на три групи. До першої групи належать різні ферменти (целюлози, протеази, ліпази) і полісахариди. Сфера використання тих чи інших речовин надзвичайно широка — від харчової і текстильної промисловості до нафтодобувної. Другу групу утворюють первинні метаболіти, тобто речовини, які необхідні для росту і розвитку самої клітини: амінокислоти, пуринові і піримідинові нуклеотиди, вітаміни. До третьої групи належать вторинні метаболіти — речовини, які не потрібні для росту мікроорганізмів. Їх синтез спостерігається після вичерпання мікробними клітинами джерела вуглецю і енергії. У цю групу входять антибіотики, токсини, алкалоїди, фактори росту [Герасименко, 1989]. Мікроорганізми вирощують з використанням двох методів – періодичне і неперервне культивування. При періодичному методі культуру засівають у живильне середовище і культивують за умов відповідної температури, аерації, перемішування. Культура росте спочатку повільно, поступово її ріст прискорюється і досягає максимуму (логарифмічна фаза росту). Концентрація вуглецю і енергії поступово знижується, починають накопичуватися продукти обміну. Відтак настає період, коли приріст клітин припиняється, а згодом клітини відмирають. Від’ємно-доливний спосіб полягає в тому, що з посудини, в якій культивуються мікроорганізми вилучають частину клітин та продукти обміну і вносять відповідний об’єм живильного середовища. Якщо процедуру виконувати часто з певною періодичністю, то можна перейти до неперервного способу культивування мікроорганізмів [Герасименко, 1989]. Мікроорганізми використовують як біогенні агенти для трансформації деяких речовин, очистки вод, ґрунтів, повітря. Для добування металів із простих і складних руд (біотехнологія металів) використовують тіонові бактерії. Важлива роль мікроорганізмів у створенні, підтримці і збереженні ґрунтового плодоношення. Мікроорганізми беруть участь в утворенні гумусу, трансформують отруйні речовини в неотруйні або детоксикують їх. У біотехнології мікроорганізмів завдяки широкому спектру досліджень виділяють ґрунтову біотехнологію, одним із напрямків якої є використання мікроорганізмів для інокуляції (обробки насіння) рослин з метою створення симбіозу між азотофіксуючим мікроорганізмом і рослиною. Завдяки цьому можна зменшити внесення мінеральних азотних добрив або не вносити їх взагалі. Ще одним напрямком є використання мікроогранізмів для боротьби з хворобами рослин: рослини обробляють певними бактеріями, які зменшують розмноження патогенних форм мікроорганізмів [Смирнов, Иванов, 1986].

2. Ферменти – термолабільні сполуки. Це означає, що під дією високих температур вони денатурують. Спочатку при підвищенні температури активність їх різко знижується, потім зовсім припиняється. При 80° С ферменти руйнуються. Виняток становлять лише окремі ферменти, що витримують те­мпературу 100° С і при цьому не руйнуються. За низьких темпе­ратур (нижче 0⁰ С) ферменти припиняють свою дію, але не руй­нуються. Для більшості ферментів людини і ссавців оптималь­ною температурою дії є 37 - 40° С.

Таким чином, чутливість до температури – характерна властивість ферментів, що пояснюється їх білковою природою.

Кожний фермент проявляє свою максимальну дію при відпо­відній концентрації водневих йонів, тобто при певному значенні рН, яке одержало назву рН-оптимуму. Для більшості ферментів людини і ссавців оптимальне значення рН знаходиться в слабокислому або слаболужному середовищі. Проте відомі ферменти, що проявляють максимальну активність при рН = 1,5 - 2,5 (напри­клад, пепсин шлункового соку) і при рН = 8,00 (наприклад, хімотрипсин дванадцятипалої кишки).

Зміна каталітичної активності ферменту за різних значень рН пояснюється в першу чергу зміною тієї просторової конфігу­рації, за якої проявляються його каталітичні властивості.

Однією з найважливіших особливостей, що відрізняє ферменти від інших каталізаторів, є висока специфічність їх дії. Вона полягає в тому, що кожний фермент діє на певну речовину (субстрат) або на декілька близьких за своєю хімічною структурою речовин. Залеж­но від того, може фермент каталізувати одну реакцію (діяти тільки на одну речовину) чи декілька (діяти на групу близьких за будо­вою речовин), розрізняють абсолютну і відносну специфічність. Прикладом абсолютно специфічного ферменту може бути фермент уреаза, який розщеплює сечовину на вуглекислий газ і аміак. На­віть на таку близьку до сечовини речовину, як тіосечовина, уреаза вже не діє. Більшість ферментів має відносну специфічність. До таких ферментів належать естерази, які розщеплюють ефірні зв'яз­ки, протеолітичні ферменти травного каналу, що розщеплюють пептидні зв'язки в білкових молекулах, ліпази та ін.

Серед ферментів є також і такі, що проявляють свою дію за­лежно від просторової конфігурації, тобто мають просторову специфічність. Так, ферменти, які окиснюють D-амінокислоти, не окиснюють їх L-форми. Слід підкреслити, що специфічність будь-якого ферменту завжди проявляється в чітко визначених умовах, зокрема, при певній концентрації йонів водню.

Ферменти прискорюють перебіг хімічних реакцій як у бік розщеплення якоїсь речовини, так і в бік її синтезу, тобто діють в обох напрямках.

Крім температури і значення рН, на активність ферментів впливає ще цілий ряд чинників, серед яких велике значення має концентрація субстрату. За малих концентрацій субстрату реак­ція відбувається з малою швидкістю, з підвищенням концентра­ції швидкість реакції поступово зростає і за певних значень стає постійною. Відбувається процес так званого насичення фермен­ту субстратом. Подальше збільшення концентрації субстрату призводить до уповільнення реакції. Велике значення для швид­кості реакції має і концентрація самого ферменту. За оптималь­ної концентрації речовини швидкість реакції прямо пропорцій­на концентрації ферменту в розчині.

На активність ферментів впливають хімічні сполуки, що знахо­дяться в реакційній системі. Одні з них підвищують активність ферментів і називаються активаторами. Ними можуть бути каті­они металів і аніони кислот: Са²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Со²⁺, Сl^-1 і ін. Актива­торами ферментів можуть бути також органічні речовини. Наприк­лад, ліпаза підшлункової залози, яка розщеплює жири, активується жовчними кислотами. Відомі випадки, коли активність ферментів підвищується при додаванні до розчину невеликих кількостей біл­ків, які самі по собі не мають властивостей ферментів.

Речовини, що знижують активність ферментів, називаються інгібіторами. Ними є, наприклад, катіони важких металів.

3. Відповідно до нової номенклатури назви ферментів склада­ються з двох частин. Перша частина вказує на назву субстрату, друга - на природу хімічної реакції, яку здійснює фермент, із додаванням суфіксу -аза. Якщо фермент каталізує реакцію між двома субстратами, то в першій частині назви ферменту дають назви обох субстратів, розділених двома крапками, в другій - указують тип хімічної реакції з додаванням суфіксу -аза.

Таким чином, згідно з прийнятою класифікацією і номен­клатурою ферментів, у назві ферменту відображується тіне хімічної реакції, яку вони каталізують, а сам фермент має свій шифр, який ставиться після назви ферменту в дужках.

Розглянемо на прикладах назви і шифри деяких ферментів.

1. Оксидоредуктази - ферменти, що каталізують окисно-від­новні реакції, тобто перенесення електронів і атомів водню від однієї речовини (донатора) до іншої (акцептора). У результаті реакцій, що каталізуються оксидоредуктазами, клітини одержу­ють хімічну енергію.

Оксидоредуктази - це складні ферменти. Кофакторами в їх складі можуть бути нікотинамідні коферменти (НАД і НАДФ), флавіннуклеотиди (ФМН і ФАД), залізопорфіринові комплекси (гем) і багато катіонів (Fe²⁺, Fe³⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ і ін.). Зазначені кофак­тори спроможні виконувати роль акцепторів електронів і атомів водню і передавати їх іншим речовинам.

Назва ферментів будується за такою загальною схемою: до­натор (або субстрат): акцептор - оксидоредуктаза.

Поряд з цим застосовується також робоча номенклатура оксидоредуктаз, в основі якої лежить назва акцептора електронів і водню. Так, якщо акцептором є кисень або пероксид водню, такі оксидоредуктази називають відповідно оксидазами і пероксидазами. Оксидоредуктази, що передають електрони і водень на якийсь інший акцептор, крім кисню і пероксиду водню, назива­ють дегідрогеназами. Таких оксидоредуктаз переважна більшість.

Клас оксидоредуктаз містить цілий ряд підкласів і підпідкласів (у шифрі ферментів це відповідно друга і третя цифри). У підкласі оксидоредуктаз відображені групи речовин, що окиснюються (тобто донатори електронів і атомів водню), кожна з яких має свій певний порядковий номер. Наприклад, цифрою 1 завжди позначається спиртова ОН-група, цифрою 2 - альдегідна або кетонна група. Підпідклас в аналізованому класі вказує на акцептори електронів і атомів водню (це не що інше, як кофак­тори оксидоредуктаз), які так само, як і донатори (групи, що окиснюються), мають свої певні номери. Цифра 1 у підпідкласі, на­приклад, означає, що акцептором електронів і водню є нікотин­амідні коферменти (НАД і НАДФ).

Скажімо, фермент спиртового бродіння алкогольдегідрогена­за відповідно до номенклатури має таку назву: алкоголь: НАД -оксидоредуктаза (КФ 1.1.1.1). Перша цифра шифру показує на­лежність ферменту до класу оксидоредуктаз; друга - до підкла­су оксидоредуктаз, що окиснюють спиртові групи; третя - до підпідкласу оксидоредуктаз, кофактором яких є НАД; четверта - порядковий номер ферменту в підкласі. Перелік підкласів, під-підкласів і порядкових номерів для будь-якого класу поданий у спеціальному довіднику за номенклатурою ферментів.

2. Трансферази – клас ферментів, що каталізують транспорт різноманітних хімічних груп від однієї речовини (донатора) до іншого (акцептора). Назва ферменту будується за схемою: донатор: акцептор - група-трансфераза. Наприклад, системати­чна назва ферменту гексокинази записується так: АТФ: D-гек-созо-6-фосфотрансфераза (КФ 2.7.1.1). Це означає, що фермент належить до другого класу (трансфераз), сьомого підкласу (пере­носить фосфатні групи), до першого підпідкласу (акцептором є речовини зі спиртовою групою, у даному випадку гексоза), по­рядковий номер ферменту в підпідкласі - перший.

Клас трансфераз бере участь в обміні білків, ліпідів, вуглево­дів, нуклеїнових кислот і налічує близько 800 ферментів.

3. Гідролази – ферменти, що каталізують реакції розщеп­лення речовин за участю води. Каталітична активність цих фер­ментів залежить від наявності в їх каталітичному центрі HS-груп. Відповідно до систематичної номенклатури назви гідролаз складаються за схемою: субстрат - гідролаза. Наприклад, фермент АТФ-аза називається АТФ-фосфогідролазою (КФ 3.6.1.3). Він належить до третього класу (гідролази), шостого підкласу (розщеплює кислоангідрідні зв'язки), першого підпід­класу (ці зв'язки знаходяться в молекулі АТФ), порядковий но­мер даного ферменту в підпідкласі - третій.

Гідролази дуже поширені в природі і беруть участь в обміні вуглеводів, жирів, білків та інших сполук.

4. Ліази – ферменти, що каталізують реакції негідролітичного відщеплення певних груп з утворенням подвійних зв'яз­ків або приєднання групи в місці подвійного зв'язку. Ці реакції здійснюються без використання енергії макроергичних сполук. Систематичні назви ферментів цього класу будуються так само, як і назви гідролаз, тобто за схемою: субстрат - відщеплювана група-ліаза. Наприклад, аспартат-аміак-ліаза за систематич­ною номенклатурою називається L-аспартат-аміак-ліаза (КФ 4.3 1.1). Це означає, що фермент належить до четвертого класу (ліаз), третього підкласу (каталізує розрив зв'язку між атомами Карбону й Нітрогену), до першого підпідкласу (відщеплює аміногру­пу), а порядковий номер його в підпідкласі - перший.

Ліази, як правило, – складні ферменти, що містять як кофак­тори фосфорні естери водорозчинних вітамінів.

5. Ізомерази - ферменти, що каталізують реакції внутрішньомолекулярного переміщення різних груп або реакції утво­рення ізомерів. Типовим прикладом ферментів цього класу є тріозофосфатізомераза, систематична назва якої D-гліцеральдегід-3-фосфат-кетолізомераза (КФ 5.3.1.1). Даний фермент обо­ротно перетворює 3-фосфогліцериновий альдегід у діоксіацетонфосфат.

6. Лігази (синтетази) - ферменти, за участю яких здійсню­ється приєднання одна до одної двох молекул із використан­ням енергії АТФ і утворенням нових зв'язків. Лігази назива­ють ще синтетазами, оскільки вони є каталізаторами синтетич­них реакцій. Це складні ферменти. Кофактором багатьох із них є вітамін Н, або біотин. Найбільш вивченими ферментами цього класу є карбоксилази, наприклад, ацетил-КоА - карбоксилаза, си­стематична назва - ацетил-КоА: СО₂-лігаза (АДФ) (КФ 6.4.1.2). Фермент каталізує утворення так званого малоніл-КоА - проміж­ної сполуки в біосинтезі вищих жирних кислот з ацетил-КоА і вугільної кислоти.

4. Переважна більшість ферментів діє всередині клі­тини, де вони утворилися, тобто являє собою так звані ендоферменти. При цьому для них характерна певна клітинна локалізація.

Загалом локалізацію найважливіших груп ферментів усере­дині клітини можна уявити таким чином. У розчинній частині клітини у вигляді окремих молекул знаходяться численні важ­ливі групи ферментів: ферменти, що каталізують процеси ана­еробного дихання або спиртового бродіння, перетворення сахарів, розщеплення крохмалю - - і -амілази. У цій же частині локалізовані всі ферменти синтезу вищих жирних кислот, бага­то ферментів, що каталізують синтез і взаємні перетворення амі­нокислот, а також численні гідролітичні ферменти.

Ряд ферментів локалізовано в органелах клітини – ядрі, мітохондріях, рибосомах і т.д. В ядрі в основному знаходяться ферменти, що каталізують утворення нуклеїнових кислот. Усі ферменти і кофактори дихального ланцюга, а також усі фермен­ти окиснювального фосфорилювання, які мають відношення до утворення АТФ у клітині, локалізовані в мітохондріях. Тут же міститься повний набір ферментів, що каталізують реакції цик­лу трикарбонових кислот, а також ферменти, що каталізують окиснення жирних кислот. Крім того, у мітохондріях локалізовано багато амінотрансфераз, що каталізують реакції переамінування, і такий ключовий фермент азотистого обміну як глутаматдегідрогеназа.

Ферменти біосинтезу білків зосереджені переважно в рибо­сомах. У них містяться також ферменти, що каталізують біосин­тез рибонуклеїнових кислот.

5. Ферменти широко використовуються в народно­му господарстві. Так, у процесі випікання хліба застосовують ферментні препарати, що покращують якість і аромат хліба. Для збереження м'яса, фруктових соків, непастеризованих пива і вина як антиокиснювач використовується глюкозооксидаза. У шкі­ряному і хутряному виробництві застосовуються препарати пептидогідролаз, які в кілька разів прискорюють розм'якшення шкір і видалення з них шерсті.

Багато ферментів застосовуються в терапії. Так, препарат трипсину разом з антибіотиками використовується при ліку­ванні хронічних виразок кінцівок і фурункулів. Панкреатична ДНК-аза застосовується при лікуванні деяких респіраторних за­хворювань, гіалуронідаза – для прискорення всмоктування різ­них ліків, які вводяться підшкірно. Для руйнування тромбів часто застосовують фібринолізин. Аспарагіназа, яка розщеплює аспарагін, необхідна для синтезу білків раковими клітинами, за­стосовується при лікуванні злоякісних пухлин.

На думку вчених, еру антибіотиків і гормональних препара­тів заступає ера ферментів. Проте широке використання ферме­нтів обмежене їх малою стабільністю при зберіганні, швидкою інактивацією під впливом внутрішніх середовищ організму, си­льними імунологічними реакціями, високою вартістю і нездат­ністю до регенерації. Тому вже на даний час значна кількість ферментів застосовується не у вільному стані, а будучи закріпле­ними на органічних і неорганічних носіях. Такого роду системи називають іммобілізованими ферментами. Іммобілізація фер­ментів, як правило, підвищує їх стабільність при зберіганні, стій­кість до температурних змін агентів, які денатурують, дії мікро­організмів. Часто у ферментів, які зазнали іммобілізації, зміню­ється специфічність до субстрату. При розщепленні субстратів іммобілізовані ферменти можуть давати інші продукти, ніж ті самі ферменти, вміщені в розчин, У ряді випадків з'являється особлива субстратна специфічність. Таким чином, завдяки ім­мобілізації ферментів, тобто зв'язуванню їх із неорганічними або органічними носіями, значною мірою усуваються вади, які обме­жують їх застосування.

Іммобілізовані ферменти широко використовуються для діа­гностики і лікування різних захворювань, а також для створен­ня більш досконалих протезів і апаратів, які замінюють роботу найважливіших органів людини. Методи іммобілізації фермен­тів відкривають принципово нові підходи в конструюванні апа­ратів "штучна нирка" і "штучна печінка". Так, на основі іммобілізованої уреази створені і пройшли успішні випробуван­ня портативні апарати "штучна нирка".

Практична медицина застосовує різноманітні типи пов'язок і тампонів з іммобілізованими на їх поверхні ферментами. Із застосуванням іммобілізованих ферментів розроблені більш то­чні й економічні методи масових клінічних аналізів для визна­чення глюкози, молочної кислоти й інсуліну в крові, сечовини в сироватці крові, лактози в сечі, пеніциліну у фармацевтичних препаратах.

Прикладом іммобілізованих ферментів може бути уреаза, яку використовують для визначення сечовини в біологічних рі­динах. Іммобілізована уреаза може "працювати" безупинно про­тягом чотирьох місяців, а зберігатися без втрати активності упродовж трьох місяців при температурі від 0 до 5° С. Іммобілі­зована на нейлоні уратоксидаза дозволяє визначати сечову кис­лоту з точністю до 10^-5 – 10^-4 моль. Система іммобілізованих фер­ментів для визначення піровиноградної і щавлево-оцтової кис­лот має велику стабільність для проведення 800-1000 аналізів, тоді як ферменти в розчині за той же період часу втрачають активність на 90%.

Іммобілізовані ферменти поступово впроваджуються також у практику для оцінки забруднення навколишнього середовища токсичними речовинами.

Біотехнологія (від лат. bios – життя, technos – архітектура, мистецтво logos – наука) — нова галузь науки і виробництва, що ґрунтується на використанні біологічних процесів і об’єктів для виробництва економічно важливих речовин і створення високопродуктивних сортів рослин, порід тварин і штамів мікроорганізмів У буквальному розумінні слова біотехнологія — це “біологія + технологія”, тобто використання фундаментальних біологічних знань у практичній діяльності, спрямованій на виробництво лікарських препаратів, ферментів, білків, барвників, вітамінів та інших біологічно активних сполук, генетичному конструюванні організмів тощо [Cассон, 1987]. Сучасна біотехнологія ґрунтується на основних досягненнях біохімії, мікробіології, генетики, молекулярної біології, клітинної біології, екології та інших біологічних і технічних наук. Основними напрямками біотехнології є: промислова мікробіологія, біотехнологія виробництва ферментів та фармацевтичних препаратів, біотехнологія переробки відходів та вторинних продуктів, біотехнологія збагачення руд, біотехнологія виробництва етанолу (метанолу) та біогазу, технологія рекомбінантних ДНК, одержання гібридів та клональна біотехнологія.

Історично біотехнологія виникла на основі традиційних мікробіологічних виробництв, оскільки більшість подібних “технологій” необдумано застосовувалися ще у давнину при отриманні вина, пива, хліба тощо. Дальший розвиток цих традиційних біовиробництв був пов’язаний з досягненнями у біохімії та інших науках біологічного циклу. Так, завдяки стрімкому прогресу вірусології (у дослідженнях бактеріофагів), бактеріології (поглибленому вивченню фізіології, генетики і молекулярної біології кишкової палички, а також вивченню плазмід), молекулярної генетики (встановлення генетичного коду) і ензимології (відкриття ферментів рестрикції) були накопичені знання і розроблені методи генної інженерії [Герасименко, 1989]. У 1953 році Сенгер встановив повну структуру білка інсуліну, а Уотсон і Крік довели подвійну структуру молекули ДНК. У 1963 році Ніренберг розшифрував генетичний код та довів його універсальність як для бактерій, так і для вищих організмів та людини. У 60-их роках внаслідок удосконалення аналітичних методів, запропонованих Сенгером, та встановлення у 1967 році Едманом і Беггом закономірностей процесу деградації білків з’явилася можливість автоматично визначати структуру білків. У 1978 році було встановлено послідовності більше, ніж для 500 білків. Був складений електронний атлас білків [Rosnay, 1981 — Cассон, 1987]. Процес аналітичного визначення структури продовжує удосконалюватися. У 1963 році на основі досліджень Меріфілда були створені перші прилади, завдяки яким став можливим автоматизований синтез поліпептидів на основі структури ДНК. У 1980 році Ітакура створив перший синтезатор генів на основі відомої структури білків [Cассон, 1987]. Таким чином, розвиток біологічних знань є результатом технічного прогресу, тоді як біологічна наука, збагачена досягненнями ензимології та генетики, може створити систему взаємозв’язаних галузей біотехнології. Перевагою цих галузей буде те, що в їх основі буде лежати функціонування природних систем, метаболічні механізми яких будуть підпорядковані інтересам людства.

БІОТЕХНОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ

Основою біотехнології як науки у процесі її формування стала мікробіологічна промисловість. Мікроорганізми, порівняно з іншими об’єктами, мають такі переваги: висока швидкість росту; використання для життєдіяльності дешевих субстратів; стійкість до зараження чужою мікрофлорою. Саме завдяки таким ознакам мікроорганізмів за останні роки мікробіологічна промисловість набула принципово нових рис: мікроорганізми стали використовувати не тільки як засіб підвищення інтенсивності біохімічних процесів, але і як мініатюрні синтетичні фабрики, що здатні виробляти, синтезувати цінні й складні хімічні сполуки. Ключовим моментом у розвитку біотехнології мікроорганізмів було відкриття і початок виробництва антибіотиків [Герасименко, 1989]. На сьогоднішній день завдяки біотехнології мікроорганізмів отримані такі сполуки: алкалоїди, амінокислоти, антибіотики, антиметаболіти, антиоксиданти, білки, вітаміни, гербіциди, інгібітори ферментів, інсектициди, іонофори, коферменти, ліпіди, нуклеїнові кислоти, нуклеозиди і нуклеотиди, окисники, органічні кислоти, пігменти, поверхнево активні речовини, полісахариди, антипухлинні агенти, розчинники, фітогормони, ферменти тощо [Сассон, 1997]. Значний вклад у розвиток біотехнології як науки в цілому і біотехнології мікроорганізмів зокрема внесли дослідження петербурзького академіка К. С. Кірхгофа, який у 1814 р. відкрив явище біологічного каталізу і намагався біокаталітичним шляхом отримати цукор із доступної сировини [Мишунин, Шевченко, 1989]. У 1891 р. у США японський біохімік Дз. Такаміне отримав перший патент на використання ферментних препаратів у промислових цілях. У 1916–1917 рр. російський біохімік О. М. Колєнєв намагався розробити спосіб, який дозволив би керувати процесом ферментації природної сировини при виробництві тютюну [Мишунин, Шевченко, 1989]. Академік О. Н. Бах та його учні розробили рекомендації щодо удосконалення технології хлібопечення, пивоваріння, виноробства, виробництва чаю та тютюну тощо, а також рекомендації для підвищення врожаю культурних рослин шляхом управління біохімічними процесами, що в них протікають. У першій половинні ХХ ст. технологічне забезпечення мікробіологічних процесів було вдосконалено. Почали впроваджувати спеціально підібрані чисті культури мікроорганізмів, які спрямовували процес у потрібному напрямку. У 1933 р. голландські вченні А. Клюйвер і Л. Х. Ц.Перкін запропонували основні технічні прийоми і підходи до оцінки отриманих результатів при глибинному культивуванні грибів. Також здійснювалась розробка і впровадження технології неперервного культивування. Одними з перших вивченням безперервних процесів займалися російські вчені С. В. Лебедєв, М. Д. Утенков, Д. Н. Клімовський [Попова, Попова, 2000]. Однак, незважаючи на суттєві досягнення, природні мікроорганізми, як правило, володіють низькою продуктивністю тих речовин, виробництво яких необхідне. Для біотехнології важливим є використання високопродуктивних штамів мікроорганізмів. Їх створюють направленим відбором спонтанних або індукованих мутагенів. Отримання таких штамів займає іноді багато років. У результаті селекції продуктивність продуцентів може зростати у сотні-тисяч разів. Наприклад, у роботі з Penicillium методами селекції вихід пеніциліну був збільшений приблизно у 10 тис. разів, порівняно з вихідним штамом. Відбору високопродуктивних штамів передують тонкі маніпуляції селекціонера з вихідним генетичним матеріалом. При цьому використовують весь спектр природних способів рекомбінації генів, відомих у бактерій, а саме: кон’югацію, трандукцію та інші генетичні процеси. Наприклад, кон’югація (обмін генетичним матеріалом між бактеріями) була успішно використана при створенні штаму Pseudomonas putida, що здатний утилізувати парафіни нафти [Герасименко, 1989]. Дуже часто використовують трансдукцію (перенесення гена від однієї бактерії до іншої за допомогою бактеріофагів), та ампліфікації, тобто збільшення числа копій потрібного гена. У багатьох мікроорганізмів гени біосинтезу антибіотиків та їх регулятори знаходяться не в основній хромосомі, а в плазмідах. Завдяки ампліфікацій можна збільшити кількість плазмід у клітинах та суттєво збільшити виробництво антибіотиків [Герасименко, 1989]. Наступним підходом в генетико-селекційній роботі є отримання генетичних рекомбінант шляхом злиття різних штамів бактерій, позбавлених клітинних стінок. Так, завдяки злиттю клітин 2-х штамів Streptomyсes був сконструйований новий високоефективний штам-продуцент рифампіцину С. На мікробіологічній основі намагаються виробляти паливо: метан і спирт. Спирт, отриманий мікробіологічним шляхом, конкурує з бензином за своїми властивостями, а також за важливими з точки зору охорони природи показниками: продукти згоряння спирту не забруднюють навколишнє природне середовище. Мікроорганізми використовують для виробництва білків одноклітинних організмів, які є кормом для тварин. Перспективність мікробіологічного виробництва полягає в тому, що по-перше, немає необхідності у великих площах – один апарат для отримання кормових дріжджів з парафінів нафти дає стільки ж білка, скільки міститься в урожаї гороху з 18 тис. га. Таке виробництво не залежить від кліматичних умов, його обслуговує невелика кількість робочої сили [Смирнов, Иванов, 1986]. При вирощуванні мікроорганізмів (переважно дріжджів) для цих цілей як живильний субстрат для їх росту використовують відходи інших галузей промисловості. Мікробна біомаса деяких культур використовується у вигляді заквасок, наприклад, для випікання хліба, виробництва пива, вин, спирту, оцту, кисломолочних продуктів, сирів. Мікробний білок (зруйновані клітини дріжджів чи бактерій) використовується як добавки в живильне середовище при вирощуванні мікроорганізмів для наукових і практичних цілей.

ПИТАННЯ ДЛЯ КОНТРОЛЮ:

1. Охарактеризуйте біологічний каталіз. М

2. Які методи біологічної хімії, які використовуються для виділення і очищення ферментів, вам відомі? Охарактеризуйте їх.

3. Охарактеризуйте властивості ферментів.

4. Розкрийте принципи і сучасний стан класифікації ферментів.

5. Розкажіть про локалізацію ферментів в клітині.

6. Що вам відомо про промислове виготовлення і практичне використання ферментів?