2/ Виділення копрокультури, уринокультури, білікультури, розеолокультури та виділення чистої культури з секційного матеріалу.

Після добової інкубації посівів вивчити культуральні властивості збудника на диференціально-діагностичних середовищах, ріст збудника у збагачувальному середовищі, його морфологічні, тинкториальні властивості, антигенну структуру та пересіяти типові колонії на середовище Олькеницького (характер ферментації збудниками компонентів середовища наведено при вивченні гемокультури).

На середовищах Ендо, Плоскірева, вісмут-сульфітному агарі збудники черевного тифу, паратифів А і В утворюють лактозонегативні колонії (характеристика культуральних властивостей збудника наведена при вивченні гемокультури). Ріст збудника у селенітовому бульйоні викликає його помутніння. Важливо на цьому етапі провести первинну серологічну ідентифікацію збудника аглютинуючою полівалентною О-сироваткою до сальмонел груп АВСDЕ.

В разі негативного результату прямого посіву матеріалу на диференціально-діагностичні середовища необхідно зробити пересів зі збагачувального середовища на диференціально-діагностичні середовища, посіви проінкубувати у термостаті протягом доби і провести виділення чистої культури за наведеною вище методикою.

ІІІ етап ─ ідентифікація чистої культури.

Виділені культури ідентифікують за біохімічними властивостями, антигенною структурою та фаголізабельністю.

Біохімічні ознаки тифо-паратифозних мікроорганізмів вивчити на середовищах Гісса (табл.2). Біохімічні ознаки дозволяють диференціювати сальмонели від схожих з ними деяких ентеробактерій.

Першочергово необхідно звернути увагу на характер ферментації лактози – всі сальмонели є лактозонегативними мікроорганізмами. Характер ферментації глюкози, мальтози та маніту дає можливість диференціювати збудника черевного тифу (ферментує з утворенням кислоти) від збудників паратифів А і В (характерне ще й газоутворення). По утворенню сірководню збудники черевного тифу та паратифу В відрізняються від збудника паратифу А.

Таблиця 2

Біохімічні властивості ешерихій та тифо-паратифозних бактерій

Види мікроорганізмів	Ферментація						Утворення
	лактози	глюкози	мальтози	маніту	сахарози	сірководню		індолу
Escherichia coli	кг	кг	кг	кг	кг(±)	±		+
Salmonella typhi	─	к	к	к	─	+		─
Salmonella paratyphi A	─	кг	кг	кг	─	─		─
Salmonella paratyphi B	─	кг	кг	кг	─	+		─

Умовні позначки: "+" - позитивна реакція, "─" негативна реакція, "к" - ферментація до кислоти, "кг" – ферментація до кислоти та газу, "±" – ознака непостійна.

Більш надійною є серологічна ідентифікація виділених культур в реакції аглютинації з діагностичними сироватками. Спочатку поставити реакції аглютинації на склі з сальмонельозними полівалентними груповими аглютинуючими О-сироватками, а потім - з сальмонельозними аглютинуючими моновалентними сироватками, які містять антитіла до антигенів 09 (S.typhi), 02 (S.paratyphi A) та 04 (S.schottmuelleri) відповідно до схеми Кауфманна-Уайта. Якщо виділена культура за біохімічними властивостями подібна до тифозної, але не аглютинується 09-сироваткою, її необхідно проаглютинувати з сироваткою до Vi-антигену. При відповідності культури та аглютинуючої сироватки утворюється аглютинат. За результатами поставлених реакцій визначити належність досліджуваної культури до певної серогрупи. Серовар встановити в реакціях аглютинації з сальмонельозними полівалентними та моновалентними Н-сироватками.

Виділену чисту культуру бактерій вивчити на чутливість до антибактеріальних препаратів.

В разі необхідності встановлення джерела інфекції провести фаготипування тифо-паратифозних мікроорганізмів за допомогою набору стандартних бактеріофагів.

Дослідження води проводять при розслідуванні водних спалахів захворювань з метою виявлення тифозних та паратифозних бактерій. 2-3 л води профільтрувати через бактеріальний фільтр. Фільтр з адсорбованими на них бактеріями опустити у селенітовий бульйон. Через 8-10 годин інкубації у термостаті зробити висів із селенітового бульйону на вісмут-сульфітний агар, середовища Плоскірева (Ендо, Левіна) з метою отримання ізольованих колоній і наступного виділення чистої культури. Матеріал з типових колоній пересіяти на середовище Олькеницького та ідентифікувати виділені культури.

СЕРОЛОГІЧНИЙ МЕТОД ДІАГНОСТИКИ

Серологічне дослідження крові проводиться з метою діагностики захворювання, контролю за реконвалісцентами та виявлення бактеріоносіїв.

Усе ширшого використання набуває ІФА, який є значно чутливішим методом ніж інші методи серодіагностики і дозволяє визначити антитіла різних класів (IgG, IgM, IgA).

На цей час у лабораторній практиці для серодіагностики черевного тифу та паратифів А і В застосовують реакцію Відаля та РПГА. Діагностичне значення та специфічність реакцій проявляється при їх постановці в динаміці методом парних сироваток (другу сироватку беруть через 10-12 днів). Чотириразове зростання титрів антитіл до збудників черевного тифу чи паратифів А і В – діагностичний критерій захворювання. Реакцію непрямої Vi-гемаглютинації ставлять з метою виявлення бактеріоносіїв S.typhi. Діагностичним критерієм носійства є титр IgG 1:40.

Реакцію Відаля⁷ ставлять з метою виявлення у сироватці крові хворих аглютинінів, які з‘являються у кінці 1-го - на початку 2-го тижня захворювання. Реакцію ставлять одночасно з О-, Н-черевнотифозними та А-, В-паратифозними діагностикумами. Монодіагностикуми використовують для встановлення стадії захворювання, бо вміст О- та Н- антитіл неоднаковий у різні періоди захворювання. Антитіла до О-антигену з‘являються на 1-му тижні захворювання, накопичуються у розпал захворювання та швидко зникають на момент видужання. Антитіла до Н-антигену з‘являються в розпал захворювання, накопичуються у кінці захворювання та зберігаються у високих титрах після видужання хворого протягом тривалого часу.

Для постановки реакції Відаля необхідні: антитіла (сироватка хворого), антигени (О9-, Нd-черевнотифозні, О2-, О4-, На-, Hb-паратифозні монодіагностикуми), 0,85% розчин хлориду натрію (електроліт).

Для отримання сироватки у хворого взяти 3-4 мл крові з ліктьової вени або 1 мл з пальця чи мочки вуха. Пробірку з кров‘ю поставити у термостат при t=37°С на 10-15 хвилин для згортання крові. Згусток, що утворився, відділити від стінок пробірки за допомогою пастерівської піпетки і поставити у холодильник на 30-40 хвилин для кращої рефракції згустку і більш повного відділення сироватки. Сироватку відсмоктати і зробити її робоче розведення 1:50. Потім у шести рядах аглютинаційних пробірок сироватки протитрувати від 1:100 до 1:1600 шляхом послідовного переносу 1 мл з попередньої пробірки у наступну пробірку ряду. З останньої пробірки 1 мл протитрованої сироватки видалити для отримання однакового об‘єму в усіх пробірках (табл.3).

Схема постановки реакції Відаля

Компоненти	Номери пробірок
	1	2	3	4	5	6 (Кс)	7(Кд)
0,85% розчин хлориду натрію, мл	1	1	1	1	1	1	1
Сироватка хворого в розведенні 1:50, мл	1→	1→	1→	1→	1↓	1	─
Одержане розведення сироватки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:100	─
Діагностикум, краплі	2	2	2	2	2	─	2
Інкубація у термостаті при 37°С – 2 год.; 18°С – 18 год.
Облік реакції

Умовні позначки: Кс – контроль сироватки, Кд – контроль діагностикума.

В кожну пробірку ряду, окрім шостої (контроль сироватки) добавити по 2 краплі діагностикуму. Сьома пробірка є контролем діагностикуму і містить 1 мл фізрозчину та 2 краплі діагностикуму. Штатив з пробірками струсити і поставити у термостат на 2 години, після чого зробити попередній облік результатів реакції. Остаточний облік реакції провести через 18-20 годин знаходження пробірок з реакцією Відаля при кімнатній температурі. При позитивній реакції аглютинації утворюється аглютинат білого кольору з більш-менш прозорою рідиною над ним. При негативній реакції рідина залишається каламутною. Облік реакції Відаля провести, оцінюючи послідовно кожну пробірку, починаючи з контрольних. За титр сироватки приймають найвищий її титр, в якому відбулось утворення аглютинату. Під час обліку результатів звернути увагу на характер аглютинатів: О-аглютинація буде дрібнозернистою, а Н-аглютинація – крупнозернистою.

При черевному тифі діагностичним титром антитіл реакції Відаля є титр 1:200.

У людей, що вакциновані проти черевного тифу та паратифів, також спостерігається позитивна реакція Відаля з високим титром антитіл, тому "інфекційний Відаль" відрізняється від "щеплювального" тільки по зростанню титру аглютинінів у сироватці хворого.

Останнім часом реакцію Відаля не вважають специфічною, бо вона може бути позитивною при інших захворюваннях, які характеризуються гарячкою, та при раніше перенесеній хворобі. Крім того, при ранньому застосуванні антибіотиків для лікування хворого титр антитіл є низьким і не може вважатися діагностичним.

При серологічній діагностиці черевного тифу, паратифів А і В та бактеріоносіїв останнім часом ширше використовують РНГА, особливо для виявлення антитіл до Vi-антигену.

Реакцію спочатку ставлять з сальмонельозним полівалентним еритроцитарним О-діагностикумом серогруп АВСDЕ, потім з черевнотифозним еритроцитарним моновалентним О9-діагностикумом, або, відповідно до захворювання, з паратифозним еритроцитарним моновалентним О2-діагностикумом чи паратифозним еритроцитарним моновалентним О4-діагностикумом, і, насамкінець, з Vi-еритроцитарним діагностикумом.

Антитіла до Vi-антигену при черевному тифі не мають значного діагностичного чи прогностичного значення. Виявлення антитіл до Vi-антигену є важливими для встановлення осіб, підозрілих на бактеріоносійство.

Для контролю за реконвалесцентами РНГА поставити у динаміці, а для виявлення бактеріоносіїв S.typhi поставити реакцію непрямої Vi-гемаглютинації і оцінити за чотириплюсовою системою.

У хворого на черевний тиф (паратиф А, паратиф В) першу порцію крові взяти на 7-9 добу захворювання, а другу – через 10-12 днів (кров взяти за методикою, наведеною до реакції Відаля). Сироватку крові (І та ІІ порції) розтитрувати у планшетці від 1:10 до 1:1280 (реакцію поставити за загальною методикою). Реакцію оцінити як позитивну при зростанні титру антитіл у сироватці у 2-4 і > разів.

Реакцію непрямої Vi-гемаглютинації поставити у планшетці (за загальною методикою). Компонентами реакції є сироватка особи, черевнотифозний еритроцитарний Vi-діагностикум, фізрозчин. Сироватку розтитрувати від 1:10 до 1:160. Останнім часом при постановці реакції непрямої Vi-гемаглютинації використовують пробу з цистеїном, яка дає більш достовірний результат при виявленні бактеріоносіїв S.typhi. Сироватку крові людини, яку обстежують, обробляють цистеїном, який пригнічує IgM і не впливає на IgG.

Діагностичним титром IgG для підтвердження бактеріоносійства S.typhi є титр 1:40 і вище, але для остаточного діагнозу "бактеріоносійство" потрібно обов‘язково виділити збудника з копро-, білі- чи уринокультури.