6.3 Идентификация клеток-реципиентов, содержащих рекомбинантные гены

Необходимо идентифицировать клетки, несущие ген-мишень. После трансплантации генов лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток проводят в две стадии.

Первая стадия – поиск клеток, несущих вектор, например, по приобретенной способности быть устойчивыми к антибиотикам.

Вторая стадия – поиск клеток, несущих и вектор, и ген-мишень. Для этого используют две группы методов:

а) методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов:

– определение нуклеотидной последовательности ДНК, когда из клеток, предположительно содержащих искомый ген, выделяют ДНК вектора, затем проводят секвенирование;

– гибридизация выделенной ДНК с зондом, который может быть интересующим геном или соответствующей ему м-РНК;

б) методы, основанные на определении признака, кодируемого геном:

– непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок – продукт транскрипции и трансляции гена-мишени;

– использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген-мишень, например, клетки, несущие ген β-галактозидазы культивируют на среде с лактозой;

– иммунологическая детекция, например, при поиске в бактериях α-интерферона человека его связывают с антителами, то есть ген идентифицируют с помощью специфических антител к его белковому продукту.

6.4 Экспрессия чужеродных генов

Эффективность функционирования бактериальных генов не одинакова. Бактериальные гены, включенные в геном, экспрессируются достаточно легко, так как в процессах транскрипции и трансляции всех прокариот много общего.

Экспрессия генов эукариот у бактерий происходит крайне редко, так как регуляторные участки эукариот не узнаются бактериальными ДНК – полимеразами, поэтому разработаны следующие методы защиты:

а) использование ингибиторов протеаз, например, выход человеческого интерферона увеличивается примерно в четыре раза при введении гена, отвечающего за синтез ингибиторов протеаз;

б) встраивание гена в подходящий вектор экспрессии, который уже содержит регуляторные элементы;

в) амплификация (увеличение числа копий). Суммарная активность экспрессируемого гена увеличивается с ростом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Используя многокопийные плазмиды, можно получить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1…2 тыс. копий на клетку без нарушения жизненно важных функций бактерий (обычно в клетке от 20 до 50 копий).

В настоящее время разработаны системы клонирования в бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих.

6.4.1 Клонирование в бактериях

Векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, способные существовать и в клетке E.coli, и в той клетке хозяина, для которой они предназначены. С этой целью создают гибридные векторы, содержащие репликон какой-либо из плазмид E.coli и требуемый репликон (из бактерий, дрожжей).

Bacillus subtilis – непатогенный почвенный микроорганизм; используется для производства белков и ферментов. В этих бактериях обнаружены плазмиды и фаги, генетика которых хорошо изучена. Клонирование осуществляется с помощью так называемых челночных векторов, которые способны реплицироваться в клетках нескольких хозяев: Bacillus subtilis, E.coli, Staphylococcus aureus. Векторы были получены комбинацией in vitro фрагментов плазмид Staphylococcus aureus, E.coli и хромосомных фрагментв Bacillus subtilis. Полученные рекомбинантные штаммы несут признаки устойчивости к антибиотикам.

Стрептомицеты широко применяются в биотехнологии. С помощью клонирования получены штаммы, устойчивые к антибиотикам.