3.2 Мутагенез и методы выделения мутантов
В живой клетке одновременно синтезируется множество соединений. В норме обмен веществ в клетке осуществляется в экономичном режиме. Задача биотехнолога состоит в обеспечении сверхсинтеза одного из продуктов метаболизма.
Сверхсинтез может быть осуществлен двумя путями:
1) путем спонтанного изменения генетической природы организма in vivo. Селекция (то есть направленный отбор) из природных высокопродуктивных штаммов может занимать годы;
2) путем индуцированного мутагенеза. Метод основан на использовании мутагенного действия ряда химических соединений (таких как гидроксиламин, нитрозамины, азотистая кислота, бромурацил, алкилирующие агенты и др), ультрафиолетовых и рентгеновских лучей. Мутагены вызывают замены оснований в составе ДНК, а также индуцируют мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания информации. Проводят тотальную проверку (скрининг) полученных клонов (клон – генетически однородное потомство одной клетки). Отбирают наиболее продуктивные.
В результате мутаций микроорганизма исчезает эффект катаболитной репрессии, а индуцибельные ферменты становятся конститутивными, то есть их экспрессия не зависит от присутствия в среде субстрата.
Е
сли
необходимо добиться накопления не
конечного, а промежуточного продукта
биосинтетического пути, то это может
быть достигнуто с помощью мутанта, у
которого блокирован этап синтеза:
Т
акой
мутант ауксотрофен, то есть растёт
только при добавлении в среду вещества,
служащего продуктом блокированной
реакции:
О
днако,
возможны компенсирующие мутации, ведущие
к активизации альтернативных путей
синтеза недостающих соединений:
Тогда микроорганизмы не нуждаются в добавлении вещества Г и накапливают вещество Д в сверхколичествах.
На практике высокопродуктивные штаммы часто обладают двумя видами мутаций: в них ферменты становятся конститутивными, а они сами – ауксотрофными.
3.3 Плазмиды и конъюгация у бактерий
Плазмидами называют бактериальные репликоны (внехромосомные элементы наследственности), стабильно наследуемые. Они представляют собой двуцепочные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами. Их размеры составляют от 1 до 3 % генома бактериальной клетки.
Плазмиды разделяют на конъюгативные, способные самостоятельно перенестись в реципиентные клетки с помощью конъюгации, и неконъюгативные, не обладающие этим свойством. Они детерминируют разные свойства: резистентность к антибиотикам (R-плазмиды), биодеградацию (D-плазмиды) и др.
Например, плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути. Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид E. coli. У кишечной палочки, сальмонелл и ряда других бактерий обнаружены Col-плазмиды, обеспечивающие синтез разных колицинов – высокоспецифичных антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов микроорганизмов того же вида или родственных видов. Количество плазмид в клетке может колебаться от 1 до 100. В целом, чем крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке.
3.4 Фаги и трансдукция
Трансдукция – перенос генетической информации от клетки донора к клетке реципиента, который осуществляется фагом.
Почти каждый известный в настоящее время вид бактерий является хозяином одного или нескольких фагов.
Фаги могут быть вирулентными – лизирующими зараженные ими бактерии – или умеренными – образующими с клеткой-хозяином своеобразный симбиоз. Такие фаги передаются по наследству, могут находиться в клетке в виде автономной плазмиды или интегрироваться в бактериальную хромосому.
Фаги могут нарушать процессы ферментации в результате фаголиза производственных культур бактерий. Также фаги являются важным инструментом генетического анализа и конструирования штаммов бактерий.
Явление трансдукции описали в 1952 г. Н. Циндер и Дж. Ледерберг. Оно основано на том, что в процессе размножения фагов в бактериях иногда образуются частицы, которые наряду с фаговой ДНК или вместо нее содержат фрагменты бактериальной ДНК.
При заражении новых бактериальных клеток они передают им генетические детерминанты предыдущего хозяина.