- •Бийский технологический институт (филиал)
- •Краткий курс биотехнологии
- •1 Природа и многообразие биотехнологических процессов
- •1.1 Введение
- •История развития биотехнологических процессов
- •1.3 Микроорганизмы, используемые в биотехнологических процессах
- •2 Производство белков одноклеточных организмов
- •2.1 Целесообразность использования микроорганизмов для
- •Производства белка
- •2.2 Использование дрожжей
- •2.3 Использование бактерий
- •2.4 Использование водорослей
- •2.5 Использование микроскопических грибов
- •3 Методы генетического конструирования
- •In vivo
- •3.1 Регуляция метаболизма в микробной клетке
- •3.2 Мутагенез и методы выделения мутантов
- •3.3 Плазмиды и конъюгация у бактерий
- •3.4 Фаги и трансдукция
- •3.5 Гибридизация эукариотических организмов
- •3.6 Слияние протопластов или фузия клеток
- •4 Технология производства метаболитов
- •4.1 Классификация продуктов биотехнологических производств
- •4.2 Общая схема биотехнологического производства продуктов микробного синтеза
- •4.3 Биотехнология получения первичных метаболитов
- •4.3.1 Производство аминокислот
- •4.3.2 Производство витаминов
- •4.3.3 Производство органических кислот
- •4.4 Биотехнология получения вторичных метаболитов
- •4.4.1 Получение антибиотиков
- •4.4.2 Получение промышленно важных стероидов
- •5 Биоиндустрия ферментов
- •5.1 Область применения и источники ферментов
- •5.2 Выбор штамма и условий культивирования
- •5.3 Технология культивирования микроорганизмов – продуцентов ферментов и выделение ферментов
- •5.4 Инженерная энзимология и ее задачи
- •6 Методы генетического конструирования
- •In vitro
- •6.1 Биотехнология рекомбинантных днк
- •6.2 Конструирование рекомбинантных днк
- •6.3 Идентификация клеток-реципиентов, содержащих рекомбинантные гены
- •6.4 Экспрессия чужеродных генов
- •6.4.1 Клонирование в бактериях
- •6.4.2 Клонирование в дрожжах
- •6.4.3 Клонирование в клетках животных
- •6.5 Использование генетической инженерии в животноводстве
- •6.6 Генная инженерия растений
- •7 Основы клеточной инженерии растений
- •7.1 История предмета
- •7.2 Методы и условия культивирования изолированных тканей и клеток растений
- •7.3 Дедифференцировка на основе каллусогенеза
- •7.4 Типы культур клеток и тканей
- •7.5 Общая характеристика каллусных клеток
- •7.6 Морфогенез в каллусных тканях как проявление тотипотентности растительной клетки
- •7.6.1 Дифференцировка каллусных тканей
- •7.6.2 Гистогенез (образование тканей)
- •7.6.3 Органогенез
- •7.6.4 Соматический эмбриогенез
- •7.7 Изолированные протопласты, их получение, культивирование, применение
- •7.8 Клональное микроразмножение и оздоровление растений
- •8 Экологическая биотехнология
- •8.1 Получение биогаза
- •8.2 Производство биоэтанола
- •8.3 Очистка сточных вод
- •8.3.1 Методы очистки сточных вод
- •8.3.1.1 Механические методы
- •8.3.1.2 Химические методы
- •8.3.1.3 Физико-химические методы
- •8.3.1.4 Биологический метод
- •8.3.2 Отстой сточных вод и его использование
- •9 Контрольные вопросы
- •Список литературы
- •Содержание
- •Краткий курс биотехнологии
6.6 Генная инженерия растений
Генетическая трансформация заключается в переносе чужеродных или модифицированных генов в эукариотические клетки. В качестве векторов используются плазмиды почвенной бактерии рода Agrobacteria.
Методами генной инженерии улучшают аминокислотный состав запасных белков растений; повышают эффективность фотосинтеза; улучшают процессы усвоения азота; повышают устойчивость растений к фитопатогенам, гербицидам, насекомым, к абиотичным стрессам.
7 Основы клеточной инженерии растений
7.1 История предмета
Клеточная инженерия – важное направление в биотехнологии. Оно основано на использовании принципиально нового объекта – изолированной культуры клеток или тканей эукариотических организмов, а также на тотипотентности – уникальном свойстве растительных клеток.
С помощью клеточной инженерии в области фундаментальных наук стало осуществимым исследование таких проблем, как взаимодействие клеток в тканях, клеточная дифференцировка, морфогенез, реализация тотипотентности клеток, механизм появления раковых клеток и др.
На практике клеточная инженерия используется при селекции, получении ценных метаболитов растительного происхождения, например, дешевых лекарств, безвирусных растений, их клональное размножение и др.
Тотипотентность – способность любой соматической клетки полностью использовать свой потенциал развития, то есть способность каждой растительной клетки давать начало целому организму.
В 1922 г американец В. Роббинс и немец В. Котте независимо друг от друга показали возможность выращивания меристем кончиков корней томатов и кукурузы на синтетических питательных средах. (Меристема, от греч. меристос – делимый, образовательная ткань растений, долго сохраняющая способность к делению клеток)
С этого момента начались массовые исследования, и к 1959 г. насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильных условиях на специально подобранной культуральной среде.
В 1955 г. Ф. Скуг и С. Миллер открыли новый класс фитогормонов – цитокинины. При их совместном действии с другими фитогормонами – ауксинами – появилась возможность стимулировать деление клеток, поддерживать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в контролирумых условиях.
В 1960 г. Коккинг (Великобритания) разработал метод получения изолированных протопластов. Это послужило толчком к получению соматических гибридов, введению в протопласты вирусных РНК, клеточных органелл, клеток прокариот. В это же время Дж. Морел и Р.Г. Бутенко предложили метод клонального микроразмножения, который сразу широко стал использоваться на практике. Под руководством Р.Г. Бутенко в 1969 г. была разработана технология культивирования одиночной клетки с помощью ткани-«няньки».
7.2 Методы и условия культивирования изолированных тканей и клеток растений
Выращивание изолированных клеток и тканей на искусственных питательных средах в стерильных условиях (in vitro) получило название метода культуры изолированных тканей.
Общие требования к выращиванию следующие:
– Асептика. Фрагменты ткани или органы растения – экспланты – могут быть ингибированы токсинами микроорганизмов, поэтому все операции должны проводиться в асептических условиях.
Для этого чистую посуду стерилизуют в автоклавах, питательную среду – в автоклавах или через бактериальные фильтры. Комнаты обрабатывают хлорамином, а затем ультрафиолетовыми лампами.
Сами растительные клетки могут быть источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация. Растение промывают водой с мылом, споласкивают чистой водой, затем промывают в растворах дезинфицирующих веществ (диацида сулемы, перекиси водорода) в течение от 1 до 40 мин. После выдерживания эксплантантов в дезинфицирующем растворе, их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантантов, так как он мог быть поврежден стерилизацией.
– Питательные среды. Изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах. В состав сред входят макро- и микроэлементы, углеводы, витамины, фитогормоны и их синтетические аналоги. Углеводы в концентрации от 2 до 3 % входят в состав любой питательной среды, так как большинство каллусных тканей лишено хлорофилла и не способно к автотрофному питанию. Поэтому их выращивают в условиях рассеянного света или в темноте.
В среды обязательно вводят ауксины, вызывающие дедифференцировку клеток экспланта, и цитокинины, индуцирующие клеточные деления. Добавление этих фитогормонов в различных соотношениях вызывает разные типы морфогенеза.
При приготовлении твердых питательных сред для поверхностного выращивания каллусных тканей используют агар-агар – полисахарид, получаемый из морских водорослей.
Универсальной является среда Мурасиге и Скуга, она пригодна для образования каллусов, поддержания неорганизованного каллусного роста, индукции морфогенеза у большинства двудольных растений.