Механизм ифа
В настоящее время можно получить антитела против любых интересующих нас показателей, например, гормонов, лекарственных препаратов в крови, окомаркеров, наркотиков, а не только против инфекционных агентов.
Методами ИФА возможно определение иммуноглобулинов (видовая принадлежность, субклассы, специфичность), а также идентификация лимфоцитов (субпопуляций). В настоящее время практическому здравоохранению стал доступен тИФА благодаря своей невысокой стоимости и экологической безопасности, что привело к тому, что данный метод лабораторного исследования перешёл в разряд стандартных, «рутинных» анализов. Казалось бы, врач получил в свои руки надежный и точный инструмент для безошибочной диагностики и точной оценки эффективности терапии, другими словами – возможность объективизации лечебно-диагностического процесса. Однако, к сожалению, интерпретация результатов лабораторных исследований не всегда возможна.
Общие принципы метода тИФА
Определение антител
Рассмотрим принцип определения специфических Ab методом тИФА, суть которого не зависит от биологического материала, в котором проводят анализ.
На рис. 1а показана общая схема метода, состоящего из трех стадий. Во время каждой стадии в систему добавляется очередной компонент, инкубируется некоторое время, необходимое для образования иммунного комплекса. Затем ячейка промывается для удаления не связавшихся компонентов. После этого переходят к следующей стадии реакции.
Рассмотрим подробнее процесс образования иммунного комплекса, который представлен на рис. 1а.
На твердой поверхности пластиковой лунки, изображенной на рисунке слева, сорбирован Ag любого инфекционного агента (фрагмент вируса, бактерии, простейшего и т.п.). В эту лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови больного. Если в ней содержатся Ab к инфекционному агенту, то они закрепляются на соответствующих Ag и остаются связанными при промывке. На этом первая стадия заканчивается. Это основная — "специфическая" стадия процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса.
На второй стадии анализа в лунку вносят Ab с заранее прикрепленным к ним ферментом, способные связаться с Ab человека, закрепившимися на инфекционном агенте. Это так называемый конъюгат. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то возникает “молекулярная цепочка”, на конце которой находится фермент. На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества — хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом
То есть, если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс (рис. 16). Если на первой стадии анализа иммунных комплексов не образовалось (рис. 1в), то отсутствует и вся последующая часть “молекулярной цепочки”, вследствие чего хромоген не окрашивает раствор. В нашем случае ключевым элементом является специфическое Ab из сыворотки крови больного к инфекционному агенту. По сути, мы анализируем способность некоторых из Ab в исследуемом материале, связаться с интересующим нас Ag.
В лабораторной диагностике и иммунологии такую способность принято характеризовать двумя параметрами: афинность и авидность.
Аффинность (lat. affinitas: родственность) — термодинамическая характеристика, количественно описывающая силу взаимодействия антигена и антитела в растворе.
Авидность антител — характеристика общей стабильности комплекса Ag и At. Авидность определяется аффинностью At к Ag, количеством антигенсвязывающих центров в молекуле антитела и особенностями пространственной структуры антигена, создающими препятствия для создания комплекса. Авидность описывает силу кооперативных аффинных взаимодействий.
Так, например, авидность IgM может быть высокой даже при низкой аффинности отдельных антиген-связывающих центров, так как молекула IgM имеет десять таких центров, в то время как IgG может иметь два высокоаффинных центра.
Помните специфичность, о которой мы говорили на первой лекции? С точки зрения химии и термодинамики специфичность рецепторов очень близка к понятиям «афинность» и «авидность». Нужно понимать, что рецепторы, участвующие в осуществлении процессов врожденного иммунитета ничуть не менее авидны к распознаваемым чужеродным молекулам, чем ВкР и ТкР лимфоцитов. Есть сведения, что все как раз наоборот: константа диссоциации рецепторов и их лигандов в системе врожденного иммунитета составляет 10-9 – 10-11, а адаптивного – 10-4 – 10-11. Таким образом, понятия «специфический» и «неспецифический» иммунитет отражают не силы связывания, а уникальность рецепторов. Во врожденном иммунитете рецепторы исходно имеют структуру, позволяющие распознавать универсальные паттерны, а ВкР и ТкР уникальны и формируются в результате встречи с антигеном.
Положительный результат теста показывает только наличие в исследуемом образце (обычно сыворотке крови больного) Ab, способных связываться с поверхностными Ag, сорбированными на твердой фазе. Результат анализа может существенно зависеть от свойств самой тест-системы и от особенностей иммунного ответа больного. Тест-системы на основе моноклональных-Ab позволяют достигать более высокой чувствительности и избирательности. Однако чрезмерно узкая избирательность может приводить к ложноотрицательным результатам при некоторых особенностях иммунного ответа организма больного. Многое зависит от того, какого рода Ag используется для сорбции на твердой фазе. Важна и степень очистки, и количество различных Ag, доступных для образования иммунных комплексов, и многое другое. Разумеется, все сказанное относится к полностью пригодным для использования тест-системам и безошибочному проведению процесса анализа