Порядок выполнения работы

1. Смешать в пробирке по 10 капель растворов гемоглобина и рибофлавина.

2. Открыть нижний кран колонки и выпускать из нее раствор хлористого натрия, пока верхний мениск жидкости не сравняется с верхним уровнем геля.

3. Тотчас после этого тонкой струйкой, не взмучивая верхнего слоя, нанести поверх геля 0,5—1 мл смеси гемоглобина и рибофла­вина. Подождать до тех пор, пока эта смесь не впитается в гель.

4. Когда смесь гемоглобина и рибофлавина перейдет в гелевую фазу, осторожно наслоить поверх геля 2—3 мл 0,9% раствора хло­ристого натрия. Присоединить резиновую трубку от склянки с ту­бусом к верхнему концу колонки. Установить уровень промываю­щей жидкости в склянке приблизительно на 20 см выше уровня геля.

5. При непрерывном протекании жидкости через колонку со скоростью около 20—25 капель в минуту наблюдать за перемеще­нием окрашенного кольца (элюцией гемоглобина и рибофлавина). Отметить начало расслоения окраски, их разделение. Собрать в отдельные пробирки окрашенный в красный цвет гемоглобин и желтый рибофлавин. Измерить количество промывной жидкости (элюата), вышедшее из колонки до момента выделения гемоглоби­на и рибофлавина. Эти показатели (элюционные объемы) записать в протоколе.

В выводах на основании элюционных объемов качественно со­поставить молекулярные массы гемоглобина и рибофлавина.

3.2. Диализ белка

Диализом называется освобождение коллоидных растворов от примесей, способных проникать через полупроницаемые раститель­ные, животные и искусственные мембраны (пергамент, бычий или свиной пузырь, пленки из нитроцеллюлозы, ацетилцеллюлозы, цел­лофана и других материалов). При помощи диализа постепенно происходит удаление веществ, легко проникающих через мембра­ну, например электролитов и других кристаллоидов. В то же время белки, обладая макромолекулярной структурой, не проходят сквозь полупроницаемую мембрану. Благодаря этому свойству белка диа­лиз является удобным методом очистки белковых растворов от низкомолекулярных примесей органических и неорганических.

Реактивы и материалы: сыворотка крови или раствор яичного белка, хлористый натрий, насыщенный раствор, тринитроцеллюлозная основа фотокинопленки, 8% раствор в смеси этилового спирта и эфира 1:1, азотная кислота, 10% раствор, азотнокислое серебро, 1% раствор, гидроксид натрия, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор.

Оборудование и посуда: пробирки для приготовления диализационных мешочков, скальпель, глазной пинцет, стакан с дистиллированной водой, стеклянные палочки, резиновые колечки, штатив с пробирками, капельницы.

Порядок выполнения работы

1. К 5 мл сыворотке крови или раствору яичного белка прибавляют 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия.

2. Предварительно чисто вымытую и высушенную пробирку (диаметром 2—2,5 см, длиной 4—5 см) наполняют 8% раствором тринитроцеллюлозной основы фотокинопленки и затем выливают его в склянку, из которой он был взят. Пробирку вращают между ладо­нями рук, меняя ее положение так, чтобы слой оставшегося ра­створа равномерно распределялся по стенкам и дну пробирки.

3. Для высыхания полученной на стенках пробирки пленки про­бирку в опрокинутом положении вращают между ладонями до ис­чезновения запаха эфира (5—10 минут). Более прочные мешочки можно получить нанесением повторного слоя мембраны после ис­парения эфира из первого слоя.

4. Скальпелем или ногтем осторожно отделяют верхнюю часть пленки от края пробирки и в образовавшееся пространство между стеклом и пленкой и внутрь мешочка наливают воду. Пинцетом отделяют (осторожно) мешочек от стенок пробирки и извлекают. Во избежание пересыхания мешочки до проведения в них диализа сохраняют в дистиллированной воде.

5. Проделывают с солевым раствором белка, предназначенным для диализа, биуретовую реакцию, а с дистилли­рованной водой для наполнения диализационного стакана пробу на хлориды. Для этого к небольшому количеству воды добавляют 1 каплю 10% раствора азотной кислоты и 1 каплю 1% раствора азотнокислого серебра. Осадок не выпадает, что говорит об отсутствии хлоридов.

6. В мешочек наливают (предварительно удалив из него воду) на 1/3 объема солевой раствор белка и края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновы­ми колпачками, надетыми на концы палочек.

7. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, кла­дя зажимающие мешочек палочки на края стакана. Уровень жидкости в мешочке не должен выступать над уровнем жидкости в стакане (см. рис.).

Через 1—1,5 часа от начала диализа берут две пробы (приблизительно по 10 капель) наруж­ной жидкости (диализат).

8. С одной пробой диализата производят реак­цию на хлориды, как описано в пункте 5. Выпа­дает осадок хлористого серебра. Это убеждает в том, что ионы хлористого натрия продиффундировали во внешний сосуд.

10. К другой пробе диализата прибавляют 5 капель 10% раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1% раствора сернокислой меди (биуретовая реакция).

Розоватого или фиолетово-красного окрашивания жидкости не на­блюдается, что свидетельствует об отсутствии белка в диализате.

11. Отбирают 10 капель содержимого мешочка (диализируемая жидкость) и производят биуретовую реакцию, как указано выше. Появление красно-фиолетового окрашивания доказывает то, что белок не проник через поры мембраны и остался в мешочке.