17

Лекция 5. Генетика вирусов.

Величайшие достижения середины XX века — откры­тие дискретных единиц наследственности (генов), разра­ботка хромосомной теории наследственности,' развитие биохимической генетики микроорганизмов и установление принципа «один ген — один белок», открытие регуляции активности генов прокариотов Ф. Жакобом и Ж. Моно, открытие двойной спирали ДНК Дж. Уотсоном и Ф. Кри­ком и др. создали основу для превращения генетики клас­сической в генетику молекулярную, где законы наслед­ственности и изменчивости изучаются на молекулярном и субмолекулярном уровнях.

За последние несколько лет наблюдался взрывообразный рост числа опубликованных сообщений по различным аспектам генетики эукариотических систем вообще, и системы клетка — вирус животных в частности.

Вирусы являются одним из излюбленных объектов молекулярной генетики благодаря простому строению и малой молекулярной массе их геномов, которая в 106 раз меньше массы генома эукариотической клетки. Органи­зация генетического аппарата у ряда вирусов, например у sv40, настолько сходна с таковой генов эукариотичес­кой клетки, что пблучила название минихромосомы. Минихромосома широко используется для изучения орга­низации и репликации ДНК.

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА КЛЕТКИ

В составе генома имеются структурные гены, кодирую­щие определенные* биополимеры (белки или РНК), и регуляторные гены, которые контролируют функцию струк­турных генов. Регуляция происходит с помощью белковых продуктов регуляторных генов — репрессоров, подавляю­щих активность структурных генов. Регуляторными участ­ками генов, контролирующих транскрипцию, являются усилитель транскрипции (enhancer) и промотор — об­ласть, предшествующая структурным генам и определяю­щая место специфического связывания РНК-полимеразы.

Характерной особенностью генов эукариотической клетки является их мозаичная структура, т. е. прерывис­тость гена. В составе гена, кодирующего один белок, кодирующие участки прерываются вставочными последовательностями, которые не несут никакой кодирующей ин­формации и не транслируются. Кодирующие участки гена называются экзонами, а вставки — нитронами (рис. 25).

При транскрипции считывается весь ген, включая экзоны и интроны. Впоследствии происходит созревание (процессинг) иРНК: из образовавшегося длинного пер­вичного транскрипта удаляются участки, соответствующие интронам, а участки, соответствующие экзонам, «сшивают­ся». В результате подобной модификации из первичного транскрипта образуется зрелая иРНК. Этот процесс вы­резания интронов и сшивания экзонов называется сплай­сингом (от английского слова splice — соединять, сращи­вать концы каната). Сплайсинг был впервые описан на модели ДНК-со-держащих вирусов животных — 8У40 и аденовирусов.

Строение эукариотического гена и его транскрипция.

а строение эукариотического гена 8У40: 1—усилитель транскрипции; 2—

промотор; 3— инициация репликации ДНК вируса (origin); 4— интроны; 5— экзоны (кодирующие области гена); 6— терминирующая последователь­ность ААТААА; стрелка обозначает участок начала транскрипции, б — схема сплайсинга при созревании иРНК: 1—экзоны, 2—интроны, 3—зрелая иРНК.

Основной особенностью вирусного генома является то, что наследственная информация у вирусов может быть записана как на ДНК, так и на РНК. Геном ДНК-содержащих вирусов двухнитевой (исключение составляют парвовирусы, имеющие однонитевую ДНК), несегментированный и проявляет инфекционные свойства. У вирусов, принадлежащих к родам Poxvirus и Hepadnavirus геном представлен двумя цепочками ДНК разной длины. Геном большинства РНК-содержащих вирусов однонитевой (исключение составляют реовирусы и ретровирусы, обладающие двунитевыми геномами) и может быть сегментированным (представители родов Retrovirus , Orthomyxovirus , Arenavirus и Reovirus ) или несегментированным.

Вирусные РНК в зависимости от выполняемых функций подразделяются на две группы. К первой группе относятся РНК, способные непосредственно транслировать генетическую информацию на рибосомы чувствительной клетки, т.е выполнять функции иРНК и мРНК. Их называют плюс-нити РНК и обозначают как +РНК (позитивный геном). Они имеют характерные окончания (`шапочки') для специфического распознавания рибосом.

У другой группы вирусов РНК не способна транслировать генетическую информацию непосредственно на рибосомы и функционировать как иРНК. Такие РНК служат матрицей для образования иРНК, т.е. при репликации первоначально синтезируется матрица (+РНК) для синтеза -РНК. Такой тип РНК определяют как минус-нить и обозначают -РНК (негативный геном). У вирусов этой группы репликация РНК отличается от транскрипции по длине образующихся молекул: при репликации длина РНК соответствует материнской нити, а при транскрипции образуются укороченные молекулы иРНК. Молекулы +РНК проявляют инфекционность, а -РНК не проявляют инфекционные свойства и для воспроизведения должны транскрибироваться в +РНК.

Исключение составляют ретровирусы, которые содержат однонитевую +РНК, служащую матрицей для вирусной РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При помощи этого фермента информация переписывается с РНК на ДНК, в результате чего образуется ДНК-провирус, интегрирующийся в клеточный геном.

СПОСОБЫ УВЕЛИЧЕНИЯ

ИНФОРМАЦИОННОЙ ЕМКОСТИ ВИРУСНОГО ГЕНОМА

В отличие от полицистронных иРНК прокариотов, иРНК эукариотов являются моноцистронными, т. е. реали­зуется принцип «один ген — одна молекула иРНК — один белок». Однако у некоторых клеточных иРНК и часто у вирусных иРНК этот принцип нарушается, и иРНК может направлять синтез двух белков.

У многих вирусов молекулярная масса синтезирую­щихся белков превышает теоретически рассчитанную. Этот феномен объясняется наличием у вирусов механиз­мов, позволяющих получить развернутую генетическую информацию при максимальной экономии генетического материала; подобные механизмы выработаны в процессе эволюции вирусов как генетических паразитов.

Способами увеличения генетической информации яв­ляются: 1) двукратное считывание одной и той же иРНК, но с другого инициирующего кодона; 2) сдвиг рамки трансляции; 3) сплайсинг; 4) транскрипция с перекрываю­щихся областей ДНК и др.

1) В составе иРНК обычно встречается несколько иници­ирующих кодонов. В соответствии с принятой в настоя­щее время гипотезой «сканирующей модели» Малая рибосомальная субъединица связывается с иРНК около 5'-конца и скользит вниз до встречи с инициирующим кодоном. Однако инициация в большинст­ве случаев происходит не с первого инициирующего ко­дона, а с последующих АУГ-кодонов. «Правильный» функ­ционирующий АУГ-кодон узнается рибосомой благодаря окружающим его последовательностям («фланкирующим нуклеотидам»). В том случае, если первый инициирующий кодон находится в менее благоприятном окружении, чем последующие АУГ-кодоны, большинство малых рибосо-мальных, субъединиц пройдут этот кодон и начнут ини­циацию трансляции с последующих АУГ-кодонов, одна­ко некоторые субъединицы начнут инициацию с первого АУГ-кодона. В этом случае одна иРНК может направить синтез двух белков разной длины. Такие иРНК имеются у многих вирусов: SV40, герпеса, аденовирусов, буньявирусов, реовирусов и др.

2) Трансляция может происходить без сдвига рамки и со сдвигом рамки. Генетический код является триплетным, это означает, что три нуклеотида, составляющих триплет, или кодон, кодируют одну аминокислоту. В том-случае, если триплеты сохранены и генетический код не изме­нился, то при трансляции с двух разных инициирующих кодонов будут синтезироваться полипептиды, представ­ляющие собой укороченную копию первого полипептида (трансляция без сдвига рамки).

В том случае, если произошел сдвиг на один или два нуклеотида, образуются новые триплеты (кодоны) и появ­ляется новый генетический код. В этом случае одна мо­лекула иРНК может транслироваться с образованием двух уникальных белков, т. е. таких белков, у которых нет идентичных аминокислотных последовательностей.

3) Сплайсинг со сдвигом рамки широко используется у ряда вирусов (вирусы гриппа, парамиксовирусы, буньяви-русы, аденовирусы, паповавирусы, парвовирусы и др.). Один и тот же ген парамиксовирусов (вирус Сендай) кодирует два уни­кальных белка: структурный белок Р и неструктурный белок С.

Одним из способов экономии генетического материала является нарезание полипептида-предшественника на участки разной длины, в результате чего образуются раз­ные полипептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Таким образом, число реальных генов превосходит молекулярную массу генома. Основанный на длине генома расчет числа генов неизменно приведет к ошибочным ре­зультатам. Более точные представления о числе генов можно получить путем биохимического и генетического анализов.

В результате перекрывания генов и сдвига рамки трансляции «размываются» границы генов, и понятие «ген» в известном смысле утрачивает первоначальное значение как дискретный фрагмент генома и приобретает скорее функциональное значение.

Конечная цель генетического изучения вирусов животных — понимание деталей структуры и функции вирусного генома и каждого из генных продуктов вируса.

Методы исследования генетики вирусов.

На раннем этапе генетические исследования вирусов живот­ных сдерживались из-за отсутствия подходящих методов иссле­дования индивидуального потомства при смешанном заражении. Решение этой проблемы было найдено Дульбекко [32, 33], кото­рый разработал метод бляшек для цитоцидных вирусов. Исполь­зование метода бляшек позволило точно определять количество потомства, получать чистые клональные штаммы вируса и очи­щать вирусы от других примесных вирусов и дефектных интер­ферирующих частиц того же типа вируса. С помощью этого ме­тода была получена система, пригодная для анализа условно-ле­тальных мутаций. Таким образом, в значительной степени гене­тика вирусов животных началась с введения в практику метода бляшек. В настоящее время применимость метода бляшек рас­сматривают как необходимое условие для начала исследований генетики новой группы вирусов подобно тому, как разработка метода фокусов трансформации для нецитолитических, транс­формирующих вирусов [151] послужила ключом к развитию ге­нетических исследований этих вирусов.

При изучении регуляции синтеза ви­русных нуклеиновых кислот и белков во многих системах, напри­мер у герпесвирусов, с успехом использовали ингибиторы белко­вого синтеза, такие как пуромицин или циклогексимид, а так­же ингибиторы синтеза РНК, например актиномицин Е) Разработка электрофоретических систем с высоким разрешени­ем для анализа белков и нуклеиновых кислот позволила прове­сти генетические исследования вирусов с сегментированным РНК-геномом, используя в качестве маркеров полиморфизм электрофоретической подвижности РНК-сегментов и белков Применение рестрикционных эндонуклеаз сыграло анало­гичную роль для ДНК-содержащих вирусов с использованием в качестве генетических маркеров полиморфизма подвижности фрагментов ДНК и белков.

Методы исследования транскрипции и трансляции in vitro вирусов доказали свою эф­фективность при построении физических карт, особенно в системах, где отсутствует генетическая рекомбинация. В последнее время генетические приемы используют для изучения вирусного патогенеза и иммунного ответа хозяина на вирусную инфекцию, если хотят сопоставить специфические свойства вируса с индивидуальными вирусными генами и генными продуктами. Иными словами, современный генетик, изучающий вирусы животных, охотно заимствует методы у биохимика и применяет их в генетическом анализе. Наряду с этим генетики и другие специалисты используют генетический анализ для ответа на вопросы, которым традиционно не уделялось должного внимания. Такое слияние дисциплин очень помогло генетикам и в значительной мере определило быстрый прогресс этой науки в последние несколько лет.

Мутации.

Вирусам, как и всем живым организмам, свойственны наследственность и изменчивость. На раннем этапе исследования генетики вирусов животных в основном заключались в сборе и последующей генетической и физиологической характеризации вирусных мутантов. В последнее время вирусные мутанты стали использовать в качестве специфических инструментов для исследования генетических и биохимических событий, происходящих в зараженной клетке. Работы такого рода с вирусами животных в целом запаздывали по сравнению с аналогичными работами на прокариотических системах.

Спонтанная мутация

Некоторые вирусы дают значительную долю мутантов при пассировании в отсутствие каких-либо известных мутагенов. Эти спонтанные мутации накапливаются в геномах вирусов и приводят к изменчивости фенотипа, которая является объектом селективного давления в ходе эволюции вируса.

Скорость спонтанного мутагенеза в ДНК-геномах значительно ниже (10 -8 - 10 -11 на каждый включенный нуклеотид), чем у РНК-геномных (10 -3 - 10 -4 на каждый включенный нуклеотид). Более высокая частота спонтанных мутаций связана с низкой точностью репликации РНК-геномов, которая вероятно связана с отсутствием у РНК-репликаз корректирующей активности, свойственной ферментам, реплицирующим ДНК. Наиболее часто спонтанные мутации наблюдаются у ретровирусов, что связано с более высокой частотой сбоев в обратной транскрипции, не способных к самокоррекции.

Таким образом, в то время как геномы ДНК-содержащих вирусов относительно стабильны, этого нельзя сказать об РНК-содержащих вирусах, К сожалению для генетиков, ряд факторов стимулирует неравновесие в популяции геномов, и эти факторы часто способствуют накоплению мутантов в популяции. Из-за спонтанного мутагенеза трудно поддерживать гомогенность популяции вируса. Для того чтобы обойти эту трудность, вирусы периодически реклонируют, однако мутанты часто возникают и в ходе образования бляшки, и в ходе роста вируса, поэтому бывает трудно получить генетически однородные препараты вируса с высоким титром.

Индуцированные мутации

Индуцированные мутации у вирусов получают при действии различных химических и физических мутагенов, которые подразделяют на действующие in vivo и in vitro .

Большая часть мутантов, выделенных в ходе исследования вирусов животных, получена из популяций дикого типа, обрабо­танных мутагенами. Мутагены обычно применяют для того, что­бы увеличить частоту мутаций в популяции, после чего мутанты подвергают скринингу с помощью подходящего селективного давления. Основной проблемой, связанной с использованием му­тагенов, является подбор подходящей дозы. Как правило, желательно получить мутанты, которые отли­чаются от дикого типа только одной мутацией. Для этого отбор ведут при наиболее низкой дозе мутагена, дающей достаточную частоту мутаций с желае­мым фенотипом.

В системах с вирусами животных было использовано множе­ство различных мутагенов, но все они входят в небольшое число классов, определяемых по механизму мутагенеза.

Мутагены одного класса, обычно называемые мутагенами in vitro, действуют путем хими­ческой модификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в ви­русной частице. Азотистая кислота дезаминирует основания, в первую очередь аденин, с образованием гипоксантина, который при последующей репликации спаривается с цитозином. В ре­зультате действия азотистой кислоты на аденин происходит транзиция от АТ-пары к GС-паре. Азотистая кислота дезамини­рует также цитозин, приводя к транзиции CG—>-ТА. Другим му­тагеном in vitro является гидроксиламин; он реагирует специфи­чески только с цитозином и вызывает транзицию СG—>-ТА. Боль­шой класс мутагенов in vitro представлен алкилирующими агентами, которые действуют на многие позиции в основаниях. Алкилирующие агенты — нитрозогуанидин, этанметансульфонат и ме-тилметансульфонат —являются мощными мутагенами.

Во второй класс входят мутагены in vivo, которые требуют для своего действия метаболически активной нуклеиновой кислоты.

Одна группа мутагенов in vivo содержит аналоги оснований, которые включаются в нуклеиновую кислоту в ходе синтеза по правилам нормального спаривания. Включившись, эти аналоги способны претерпевать таутомерные переходы, которые приводят их к спариванию с различными основаниями, вызывая таким образом транзиции и трансверсии. Часто используют аналоги: 2-аминопу-рин, 5-бромдезоксиуридин и 5-азацитидин.

В другую группу мутагенов in vivo включены интеркалирующие агенты, которые внедряются в стопку оснований, что при последующей репликации нуклеиновой кислоты приводит к вставкам или делециям.

Примерами интеркалирующих агентов являются акридиновые красители, такие как профлавин.

Ультрафиолет также иногда используют в качестве мутагена. Основным продуктом действия ультрафиолета являются димеры пиримидинов. В ДНК пиримидиновые димеры вырезаются. Для РНК механизм ультрафиолетового мутагенеза неизвестен.

Большинству мутаций присуще свойство возврата (реверсии) к дикому типу. Каждая мутация имеет характерную частоту реверсий, которую можно точно измерить.

Классификация вирусных мутаций.

Вирусные мутации классифицируют по изменениям фенотипа и генотипа. По фенотипическим проявлениям мутации вирусов разделяют на четыре группы:

• Мутации, не имеющие фенотипического проявления.

• Летальные мутации, т.е. полностью нарушающие синтез или функцию жизненно важных белков и приводящие к утрате способности к репродукции. Мутация является летальной, если вследствие ее нарушается, например, синтез или функция жизненно важного вирусспецифического белка, например вирусной полимеразы.

• Условно летальные мутации, т.е. мутации с потерей способности синтезировать определенный белок или с нарушением его функции только в определенных условиях. В некоторых случаях мутации являются условно ле­тальными, так как вирусспецифический белок сохраняет свои функции в определенных, оптимальных для него, условиях и теряет эту способность в неразрешающих (непермиссивных) условиях. Типичным примером таких мутаций являются температурно-чувствительные (temperature sensitive) – ts-мутации, при которых вирус теряет способность размножения при повышенных температурах (39—42° С), сохраняя эту способность при обычных тем­пературах выращивания (36—37° С).

• Мутации, имеющие фенотипическое проявление, например изменение размеров бляшек под агаровым покрытием или термостабильности, по изменению спектра хозяев, устойчивости к ингибиторам и химиопрепаратам.