Оптические методы идентификации комплексов антиген-антитело
Нефелометрия — определение концентрации взвешенных частиц и высокомолекулярных веществ в растворе, основанное на оценке интенсивности рассеяния света. Нефелометрия может быть использована для определения концентрации АГ, поскольку при добавлении к ним АТ образуются иммунные комплексы, рассеивающие проходящий свет. Нефелометрия позволяет с высокой точностью определить концентрацию IgG, IgA, IgM, подклассов IgG, C3, C4, фактора B, C-реактивного белка и некоторых других сывороточных белков. Этот метод подходит для определения белков в низкой концентрации, например IgE, уровень которого в сыворотке не превышает 1 мкг/мл. Для нефелометри оптимальны растворы низкой концентрации (в отличие от турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концентрации, поскольку в этом случае измеряется потеря проходящего света).
Чувствительность метода - 100 мкг/мл при исследовании цельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании чистых растворов. Данным методом можно проводить до 120 анализов в час.
Аппаратура для нефелометрических исследований представляет собой специализированные спектрофотометры для измерения интенсивности рассеянного света под углом к направлению падающего на раствор светового потока. Длины волн, используемые в большинстве нефелометров, находятся в диапазоне 340—650 нм.
Первым способность частиц рассеивать свет описал Дж. Рэлей (J. Rayleigh) более 100 лет тому назад. Важная в прикладном плане суть этого явления заключается в том, что интенсивность и направление светового потока, рассеянного гомогенной взвесью частиц, зависят от размера частиц в соответствии с рисунком 4.1. Рэлеевское, или симметричное, рассеяние имеет место, когда размер частиц не превышает 0,1 от длины волны — вариант «А». Частицы больших размеров рассеивают свет неравномерно. Когда размер (d) приблизительно равен длине волны светового потока (X), вперед — по направлению потока рассеивается больше света, чем в обратном направлении — случай «Б» на рисунке 3.1.
Рисунок 3.1 Рассеяние света при различных соотношениях размера частиц d и длины волны электромагнитного излучения X
Схема анализатора - нефелометра представлена на рисунке 3.2.
Рисунок 3.2. Принципиальная схема нефелометра
1- источник световой энергии; 2-полосовой фильтр; 3-кювета; 4-фотоприемник; Фо -падающий поток световой энергии; Фр-поток световой энергии, рассеянный жидкой дисперсной системой; Δλ-полоса пропускания светофильтра
Турбидиметрический метод анализа. Данный вид исследования мутных сред основан на измерении изменения интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему. Изменение потока световой энергии вызвано как поглощением, так и его рассеянием дисперсной системой. Несмотря на то, что в отношении определения концентрации Ig метод нефелометрии более чувствителен, преимуществом турбидиметрического анализа является возможность проведения измерения практически на любом колориметре или фотометре. Направления прохождения потоков световой энергии, поясняющие принципы проведения турбидиметрических исследований, показаны на рисунке 3.3. Основные компоненты, которые используются при построении нефелометрических и турбидиметрических приборов, похожи и включают источник света, фильтр и фокусирующую световой поток систему линз, кювету с образцом и детектор с устройствами отображения и регистрации результата. В качестве источника света обычно используются ртутные дуговые лампы, вольфрамо-йодистые лампы и гелий-неоновые лазеры. Лазеры излучают монохроматический свет, сконцентрированный в узкий и интенсивный луч.
Рисунок 3.3. Схема, иллюстрирующая направления светового потока