Принцип метода определения функциональной активности отдельных компонентов комплемента

Принцип метода заключается в использовании специальных реагентов (R). Реагент представляет собой сыворотку крови человека (приготавливают из пула сывороток крови, т.е. из смеси сыворотки крови, полученных от многих доноров), из которой физико-химическим методом избирательно удален конкретный компонент комплемента. В этом случае добавление реагента к исследуемым образцам сыворотки крови ограничивает активацию комплемента только тем содержанием компонента, который присутствует в исследуемом образце, а значит – определяет уровень гемолитической активности комплемента в целом (рисунок 2.1).

Рисунок 2.1 Схема определения функциональной активности С2

Методические указания к выполнению лабораторной работы

1. Проведите определение функциональной активности отдельных компонентов комплемента согласно приведенному протоколу:

А) Приготовление реагента R2 для определения гемолитической активности компонента С2. Сыворотку, полученную из крови здоровых доноров, разливают в тонкостенные пробирки по 3 мл и инкубируют в водяном термостате при 50ºС в течение 30 минут.

Б) Приготовление изотонического вероналового буфера. На 1 л раствора взвесить 5,095 г веронала и 41,5 г NaCl, довести рН до 7,40 с помощью 1 М раствором NaOH. Перед работой буфер разбавляют в 5 раз.

В) Приготовление гемсистемы проводится аналогично методу СН50 (см. Лабораторные практикум по иммунологии для студентов 3 курса, с 6). Концентрацию сенсибилизированных эритроцитов барана в верованолом буфере контролируют спектрофометрически: оптическая плотность 0,2 мл гемсистемы (ЕА) + 2,8 мл дистиллированной воды должна быть равна 1,0 на длине волны λ=412 нм.

Г) Определение гемолитической активности компонента С2. К 0,2 мл стандартизованной суспензии эритроцитов барана в изотоническом вероналовом буфере VBS добавляют 0,05 мл реагента R2 в соответствующем разведении и 0,25 мл тестируемой пробы (образец предварительно разводят в 100 раз 0,15 М NaCl). Смесь инкубируют 30 мин при 37º С, добавляют 2,5 мл 0,15 М NaCl и центрифугируют при 1500g в течение 5 мин. Степень гемолиза определяли по поглощению при λ=412 нм, измеренному против буфера.

Д) Постановка контролей. Дополнительно ставятся: контроль спонтанного лизиса гемсистемы, или контроля гемсистемы (0,2мл гемсистемы и 0,3 мл буфера)- KЕА, контроль реагента (0,2мл гемсистемы + 0,05 мл реагента + 0,25 мл буфера) –KR , контроль полного лизиса эритроцитов (0,2 мл эритроцитов и 2,8 мл дистиллированной воды) - KL. Все процедуры инкубации, добавления 2,5 мл 0,15 М NaCl ,центрифугирования и измерения оптической плотности проводятся аналогично опытным образцам (кроме KL).

Е) Учет результатов производят на основании расчета количеств эффективных молекул по формуле: Z=((OD_Х-OD_KEA-OD_KR)/ (OD_KL- OD_KEA-OD_KR))×(1,5×10⁸) ×100 , (2.1)

где Z – число эффективных молекул компонента в 1 мл сыворотки крови,

OD_Х,- оптическая плотность исследуемого образца,

OD_KEA - оптическая плотность контроля гемсистемы,

OD_KR - оптическая плотность реагента,

OD_KL - оптическая плотность контроля лизиса,

1,5×10⁸ – концентрация эритроцитов в гемсистеме,

100 – фактор разведения сыворотки крови

2. Решите предложенные задачи и сделайте заключение об изменении состояния системы комплемента