Лабораторная диагностика

Клинически на основании критериев, сформированных Международной рабочей группой в 1983 году, БВ в 50% случаев протекает бессимптомно и распознается лишь при тщательном клинико-лабораторном обследовании. Признаками заболевания могут служить: обильные гомогенные, часто пенистые выделения, прилипающие к стенкам влагалища; рН > 4,5; интенсивный рыбный запах вагинальных выделений. Субъективно имеет место картина вульво-вагинального раздражения в виде зуда и жжения, более обильное и продолжительное менструальное кровотечение, боли внизу живота, выделения желтого цвета, аднексит. Вместе с тем, и это важно учитывать, указанные проявления заболевания (зуд, жжение, выделения и т.д.) могут иметь место и при иных заболеваниях урогенитального тракта, особенно при наличии сочетанных инфекций, что настоятельно требует использования объективных данных лабораторных исследований в процессе постановки диагноза и соответственно определения стратегии терапевтических мероприятий.

Наиболее легко обнаруживаемым признаком бактериального вагиноза является запах "тухлой рыбы", который усиливается при добавлении к выделениям нескольких капель 10% КОН. Определяется рН вагинального секрета (в норме 3,0-5,0) с помощью лакмусовой бумажки, введенной пинцетом во влагалище или помещенной в каплю выделения. Во избежании ошибок в клиническом диагнозе обследование не проводят во время менструации, в течении 2-3 дней после полового сношения (сперма может изменить рН влагалища), а также на фоне использования антимикробных препаратов. Указанные выше методы, однако, следует рассматривать лишь в качестве скрининговых, поскольку рН влагалища может кратковременно изменяться и при отсутствии патологии под влиянием целого ряда неконтролируемых врачом параметров (гормональный фон, интенсивность половой жизни, национальные особенности туалета наружных половых органов, особенности питания и т.д.). Тест на наличие специфического запаха явно субъективен, результаты его подвержены искажению в связи с индивидуальными особенностями личного восприятия процедуры непосредственным исполнителем. В этой связи указанные методы могут выступать лишь в качестве дополнительных к таким объективным методам исследования как световая микроскопия.

Информативность световой микроскопии при диагностике БВ значительно выше нежели при других формах патологии человека, поскольку позволяет получить данные как о состоянии влагалищной микрофлоры, так и о степени и характере имеющих место изменений слизистой влагалища, хотя указанный метод не лишен субъективизма и требует достаточно высокого уровня подготовки специалиста в области микробиологии, гистологии и цитохимии. При этом, однако, как и вообще при микроскопии особые требования предъявляются к правилам забора исследуемого материала.

Обычно в качестве исследуемого материала используют отделяемое влагалища, но не цервикального канала или уретры, поскольку микрофлора последних не идентична и не может характеризовать БВ, хотя и несет определенную информацию о наличии воспалительного процесса, но он, как правило, вторичен и является результатом БВ. Материал наносится нетолстым слоем на 3 предметных стекла для последующей микроскопии нативного препарата, препарата, окрашенного по способу Грама (в модификации Kopeloff N. et al (1922)) и/или метиленовым синим.

Приготовление растворов:

Раствор "А": 2,5 г кристаллического фиолетового растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 3 - 4 нед.).

Раствор "Б": 12,5 г натрия карбоната растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 2 нед. до выпадения кристаллов).

Раствор йода: 1 г натрия гидрооксида растворить в 7 мл дистиллированной воды, затем добавить 5 г кристаллического йода и 0,25 г калия йодида, к полученному раствору добавить дробно 243 мл дистиллированной воды.

Смывная жидкость для обесцвечивания: 75 мл ацетона добавить к 175 мл этилового спирта.

Раствор сафранина: 5 г сафранина растворить в 15-20 мл этилового спирта и добавить до 250 мл дистиллированной воды.

Окраска мазков. Мазки фиксируют над пламенем горелки. На свободную от исследуемого материала часть стекла одновременно наносят по 6 капель растворов "А" и "Б". Смешивают стеклянной палочкой и равномерно распределяют по стеклу. Экспозиция - 2 мин.

Удаляют остатки краски и наносят раствор йода на 2 мин.

Удаляют остатки йода и наносят 10-20 капель смывной жидкости, повторяют манипуляцию до полного обесцвечивания, постоянно покачивая стекло.

Промывают водопроводной водой.

Докрашивают сафранином 2 мин.

Промывают водой, просушивают и микроскопируют.

При этом следует признать предпочтительной щадящую химическую фиксацию (ацетон, смесь Никифорова и т.д.). Непосредственную микроскопию следует осуществлять под относительно небольшим увеличением (окуляр х 2-7) с целью увеличения поля зрения и максимального охвата всех присутствующих в материале объектов без снижения различимости отдельных морфологических особенностей, что особенно важно ввиду необходимости анализа большего количества параметров, объективизирующих результаты микроскопии.

Патогномоничным признаком БВ следует считать наличие в исследуемом материале так называемых "ключевых клеток" (КК) (Рис.1), представляющих собой клетки вагинального плоского эпителия, сплошь покрытые микроорганизмами. "Ключевые клетки" - это отторгшиеся от эпителиальной выстилки интактные или литически измененные клетки, колонизированные нехарактерной для влагалища микрофлорой, среди которой необходимо отметить явное преобладание грамвариабильной коккобациллярной флоры. Микроорганизмы покрывают всю поверхность "ключевых клеток" в виде облака или вуали, в наиболее клинически выраженных случаях заполняя собой все межклеточное пространство. Указанное нередко сочетается с обилием слизи, свидетельствующей о раздражении слизистых и наличием лейкоцитов, последнее, однако, чаще имеет место при присоединении вторичной трихомонадной инфекции. Наличие гонококков для БВ нехарактерно, поскольку являясь факультативными внутриклеточными паразитами они достаточно требовательны к условиям существования и не в состоянии конкурировать с гнилостной флорой влагалища. Тогда как высокоорганизованные с эволюционной точки зрения трихомонады и другие простейшие более конкурентоспособны и могут осуществлять свое питание за счет имеющихся микроорганизмов. Все вышеуказанное, однако, в случае обнаружения трихомонад исключает возможность постановки диагноза - БВ, поскольку ведущим в данном случае является обнаружение микроорганизмов этиологическая значимость которых известна. Уместным будет заметить, что для микроскопической картины БВ нехарактерно наличие большого количества грибов рода Candida, поскольку преобладающая в количественном отношении при БВ бактериальная флора является достаточно сильным антагонистом для мицетов ввиду продукции самых разнообразных бактериоцинов, без которых выживание бактерий в условиях исключительно мощной конкуренции стало бы невозможным. При обнаружении же исследователем количественного преобладания кандид появляются основания для решения вопроса о кандидозе как самостоятельной патологии, но не БВ со всеми вытекающими отсюда последствиями в изменении тактики исследований и лечения.

Количественный критерий обнаружения "ключевых клеток" остается дискутабельным, поскольку до настоящего времени окончательно не решен вопрос о показателях нормы для микрофлоры влагалища. Вместе с тем, общепризнанным является факт превалирования в норме бактерий рода Lactobacillus, что позволяет использовать его в качестве основного при исследовании на БВ. В пользу указанного свидетельствует невозможность чрезмерного развития сопутствующей флоры, а следовательно и наличие ключевых клеток, при сохраненном количественном уровне лактобацилл. Это автоматически исключает подщелачивание среды влагалища и т.д., характерные для БВ. Руководствуясь при этом принципами диагностики более изученной формы дисбактериоза (кишечник, кожа), следует признать целесообразным дифференцирование БВ по степеням, выделяя следующие:

1 степень - компенсированный, для которого характерно полное отсутствие в исследуемом материале микрофлоры при неизмененных эпителиоцитах. Указанное состояние слизистой влагалища не рассматривается в качестве патологического, но отсутствие лактобациллярной флоры свидетельствует о принципиальной возможности заселения пустующей экологической ниши попадающими с наружных половых органов микроорганизмами и последующим формированием БВ ввиду нарушения на фоне отсутствия лактобацилл естественной колонизационной резистентности слизистой. Описанные формы могут наблюдаться при микроскопии в результате "чрезмерной" подготовки пациента к посещению врача или же после проведения интенсивной химиотерапии антибактериальными препаратами широкого спектра действия (макролиды и т.п.).

2 степень - субкомпенсированный, характеризующийся количественным снижением лактобацилл, соизмеримым с возрастанием количества сопутствующей грамвариабильной полиморфной бактериальной флоры, и появлением в поле зрения единичных (1-5) "ключевых" клеток (КК) при относительно умеренном лейкоцитозе (15-20-25 в поле зрения). КК могут быть представлены как покрытыми бактериальной флорой снаружи эпителиоцитами, так и содержащими бактерии внутриклеточно ввиду неспецифического осуществления эпителиальными клетками функций фагоцитоза.

3 степень - декомпенсированный, являющийся клинически выраженным в соответствии с симптоматикой БВ и микроскопически характеризующийся полным отсутствием лактобацилл, когда все поле зрения заполнено КК. Бактериальная флора при этом может быть представлена самыми различными, за отсутствием лактобацилл, микроорганизмами как в монокультуре так и в различных морфо- и видовых сочетаниях.

ВИДОВОЙ СОСТАВ ОБНАРУЖИВАЕМОЙ ПРИ БВ ПРЕИМУЩЕСТВЕННО АНАЭРОБНОЙ МИКРОФЛОРЫ
Грамотрицательные	Грамположительные
Bacteroides melaninogenicus	Bifidobacterium species
Bacteroides vulgatus	Peptococcus anaerobius
Bacteroides species	Peptococcus asaccharoliticus
Fusobacterium nucleatum	Peptococcus prevotii
Fusobacterium species	Peptococcus variabilis
Sphaerophorus group	Peptococcus species
Leptotrichia species	Peptostreptococcus anaerobius
Campylobacter species	Peptostreptococcus species
Veillonella species	Eubacterium species
Acidominococcus fermentas	Clostridium species

В отдельных случаях отмечается выраженный лейкоцитоз по микроскопической картине характерный для трихомонадной инфекции, однако, трихомонады при этом обнаружить не удается. В целом наличие большого количества лейкоцитов в мазке при БВ нехарактерно, что служит одним из критериев отнесения БВ к разряду дизбиозов.

В плане использования отдельных методов окраски препаратов для микроскопии следует признать преимущества окраски метиленовым синим, поскольку обилие слизи, разнообразных продуктов жизнедеятельности микробов и множества микроорганизмов различных "возрастных групп" в материале при БВ препятствует их удовлетворительному прокрашиванию по методу Грама. В этой связи возможно появление определенных трудностей при отнесении выявленных микробов к разряду Грам(+) или Грам(-) по цвету, основной фон препарата при этом бурый. В этой связи оптимальным следует признать оптимальным прокрашивание препарата метиленовым синим, что наряду с четкостью визуальных форм клеточных элементов позволяет дифференцировать грамположительную флору, прокрашивающуюся в голубые тона и грамотрицательную - в интенсивный иссиня-черный цвет. В целом для интерпретации окрашенного мазка достаточно определить наличие "ключевых клеток" и преобладание немолочнокислых бактерий, причем необходимо обнаружение любого количества "ключевых клеток" в двух полях зрения под светооптическим микроскопом.

Использование для диагностики БВ бактериологического (культурального) метода исследования, основанного на выделении чистой культуры микроорганизмов и их идентификации с последующим определением их количественных соотношений в настоящее время имеет ограниченное применение ввиду отсутствия единых представлений о показателях нормы и в связи с технической сложностью культивирования анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов, а также с малоизученностью характера и механизмов симбиотических взаимоотношений популяций влагалищной микрофлоры.

За рубежом культуральный метод диагностики БВ применяется довольно широко; имеются стандартные наборы питательных сред, с помощью которых можно определить и их чувствительность к наиболее широко применяемым в клинике лекарственным препаратам. К сожалению, в нашей стране отсутствуют стандартные селективные среды для первичного выделения и культивирования микроорганизмов, определяющих БВ. Оптимальным при этом является создание анаэробных условий культивирования (анаэростаты, газогенерирующие пакеты и др.). Разрабатываются и другие подходы к диагностике бактериального вагиноза: ДНК-диагностика, в частности цепная полимеразная реакция (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА) на уровне антигена и другие. Применение последних при БВ, однако, существенно ограничено ввиду невозможности оценки по полученным результатам количественных соотношений микроорганизмов в ассоциациях.

К разряду наиболее часто выделяемых при БВ микроорганизмов, определяющих, как полагают, характер течения процесса относят Gardnerella vaginalis. Они представляет (по данным электронной микроскопии) собой неправильные чаще округлой или коккобациллярной формы микроорганизмы размером 0,2-0,6 мкм , грамвариабельны, полиморфны с разрыхленной цитоплазмой и измененной клеточной стенкой; нуклеоид прослеживается не во всех случаях. Размножение гарднерелл осуществляется преимущественно путем образования центральной перегородки (перетяжки). Внутрицитоплазматических мембранных структур (мезосом), как правило, не обнаруживается. Цитоплазматическая мембрана двухконтурная, толщиной около 10 нм. В цитоплазме гарднерелл в зависимости от стадии жизнедеятельности выявляются многочисленные рибосомы и полисомы. Интересными являются данные по структуре клеточной стенки гарднереллы: возможно наличие 2 морфологических вариантов (гомогенная, характерная для грамположительных микроорганизмов, и рыхлая, аморфная, с наличием мембранных компонентов), что объясняет грамвариабельность окраски этого возбудителя . По периферии клеточной стенки на субмикроскопическом уровне иногда выявляется мелкогранулярная или хлопьевидная субстанция, а также нитевидные структуры - возможно, аналог микрокапсулы.

Имеются сообщения, что при фагоцитозе гарднерелл наблюдается почти полная дегрануляция лейкоцитов. Существует, впрочем пока не подтвержденное мнение, что фагоцитоз носит незавершенный характер, несмотря на формирование фаголизосом, т.е. не исключается внутриклеточное паразитирование возбудителя.

Бактериологический метод исследования позволяет, по данным некоторых авторов, выделить влагалищную гарднереллу почти у четверти больных, в отделяемом слизистых мочеполовых органов которых бактериоскопически "ключевые клетки" обнаружены не были, что подтверждает возможное наличие указанных микроорганизмов и в норме.

При комплексном обследовании пациентов, в случаях когда вероятна специфическая инфекционная патология, ассоциированная с хламидиями, микоплазмами или другими микроорганизмами, для диагностики которой используется иммунофлюоресцентный метод, следует учитывать тот факт, что на фоне выраженных форм БВ возможность неспецифических ложноположительных результатов повышается в несколько раз. Это обусловлено наличием у микроорганизмов перекрестно-реагирующих антигенов, а также наличием в исследуемом материале большого количества слизи, маскирующей антигены специфического этиологического агента. В этой связи целесообразным является при определении тактики диагностических мероприятий исключать на первом этапе именно БВ. Это является оправданным и с точки зрения терапевтических мероприятий, поскольку именно БВ характеризует снижение колонизационной резистентности слизистых, принципиально определяющей повышение риска инфицирования патогенными микроорганизмами.