2. Характерные черты цитоплазматического наследования.

Признак (заболевание встречается с одинаковой частотой у обоих полов; признак передается потомкам от матери; больная мать передает признак либо всему потомству, либо только его части в зависимости от попадания в зиготу аномальных плазмогенов от яйцеклетки (напр., одна из форм несращения остистых отростков позвонков).

2. Митохондриальные генные болезни.

Связанное с мутациями Мт-ДНК, проявляются часто в форме различных невропатий и миопатий, некоторые из них выражаются тяжелыми патологиями – синдром Пирсона, нейропатия Лебера и др., сопровождающиеся энцефалопатией, слепотой, умственной отсталостью, ранней смертностью. Передача этих заболеваний происходит исключительно по материнской линии.

Анализ многочисленных родословных и характер распространения признака в обширной человеческой популяции помогли генетикам установить характер наследования многих нормальных признаков человека, таких как курчавость и цвет волос, цвет глаз, веснушчатость, а также такие аномалии, как дальтонизм, серповидно-клеточная анемия, гемофилия, сахарный диабет, шизофрения и др.

3. Молекулярно-генетические методы изучения генома человека.

Молекулярно-генетические методы – большая и разнообразная группа методов, предназначенная для выявления вариаций или повреждений в структуре участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы), а также расшифровка первичной последовательности оснований. Молекулярно-генетические методы используются для диагностики наследственных заболеваний: обеспечивают точную диагностику моногенных заболеваний и основаны на исследовании ДНК в районе определенных генов. Несмотря на то, что молекулярно-генетические методы, как правило, весьма сложны, трудоемки и дорогостоящи, данные, полученные в процессе ДНК-диагностики намного точнее и информативнее данных других анализов.

В основе молекулярно-генетических методов лежат генно-инженерные манипуляции с ДНК и РНК. Исходным этапом всех молекулярно-генетических методов является получение образцов ДНК.

Методы получения и обработки ДНК.

1. Выделение ДНК.

ДНК может быть выделена из любого биологического материала: из крови и других жидкостей организма, различных типов тканей и клеток, содержащих ядра. У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, а также на практике часто используют хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Процесс выделения ДНК состоит из нескольких этапов: быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение и экстрагирование белков, осаждение молекул ДНК в этаноле с последующим их растворением в буферном растворе.

2. Химический синтез ДНК.

Для научных исследований ДНК не только выделяют из биологического материала, но и получают синтетически при использовании ДНК-синтезаторов – приборов для автоматического синтеза ДНК. Синтез нуклеотидов с заданной последовательностью, соответствующей одному гену, впервые был осуществлен в 1969 году. Это был аланиновой т-РНК дрожжей. Уже в 1980-е годы были успешно синтезированы функционально активные гены инсулина, соматостатина, интерферона.

3. Гибридизация с ДНК-зондами.

ДНК – зонд – это одноцепочечная ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большого размера или среди множества разнообразных молекул ДНК. ДНК-зонды можно синтезировать искусственно, если известна хотя бы часть первичной структуры нужного белка, либо выделить из генома. Затем эти последовательности клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве. Одним из методов гибридизации является блот-гибридизация. Это высокочувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. Денатурированные фрагменты ДНК переносят на плотный носитель – нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану. Далее фиксированную на этом носителе ДНК гибридизуют с радиактивно меченным ДНК- или РНК-зондом.

Выделение фрагментов ДНК стало возможным благодаря открытию ферментов – рестриктаз, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах.

Все молекулярно-генетические методы основаны на использовании различных классов ферментов, два из которых имеют наибольшее значение: ДНК-полимеразы и рестриктазы.

ДНК-полимеразы осуществляют синтез ДНК, и для их работы необходима одноцепочечная матричная ДНК с двухцепочечным участком на 3`-конце молекулы и четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов.

Рестриктазы относятся к группе ферментов-эндонуклеаз, которые делают разрезы в молекуле ДНК. Известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, каждая из которых узнает свою специфическую последовательность в двухцепочечной молекуле ДНК. Разные рестриктазы всегда разрезают ДНК в определенных местах – сайтах рестрикции, которые они способны узнавать. Чем больше сайтов рестрикции, тем больше образуется рестрикционных фрагментов. Собственная ДНК организма, продуцируещего рестриктазу, обычно модифицирована по участку узнавания, чтобы предотвратить саморасщепление. Модификация осуществляется посредством включения в ДНК бактерии модифицированных азотистых оснований благодаря особой ферментативной системе, модификации представляют собой единую систему. Эта система является своеобразным барьером, предохраняющим клетку от проникновения чужеродного генетического материала и включения его в собственный геном.

Сайты рестрикции часто используют в качестве генетических маркеров ДНК, т.к. образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в специальном геле. Зная молекулярную массу фрагментов, можно определить физическое расстояние между сайтом рестрикции и концами исходного фрагмента ДНК, что является основой метода, получившего название физического картирования.

Выделяют прямую и косвенную ДНК-диагностику, которые основаны на методах, позволяющих идентифицировать небольшой, но строго определенный фрагмент ДНК человека. Обычно для этого используют блот-гибридизацию либо амплификацию с последующим анализом полученных образцов ДНК при помощи электрофореза. Амплификация генов – многократная репликация отдельных групп генов.

Прямые методы ДНК-диагностики используются в тех случаях, когда известен ген, ответственный за возникновение наследственного заболевания и основные типы его патологических мутаций (что целесообразно для таких заболеваний как Хорея Гентингтона, фенилкетонурия и ряда др.). Так, для выявления точковой мутации, небольших делеций и инверсий используют метод секвенирования. Главное преимущество прямого метода – высокая, практически 100% точность диагностики и отсутствие необходимости ДНК анализа всех членов ядерной семьи. Еще важное достоинство – возможность выявления гетерозиготного носительства патологических мутаций у родителей умершего больного и его родственников, что особенно актуально для аутосомно-рецессивных заболеваний. Недостаток состоит в том, что для их применения требуется знание точной локализации патологического гена в геноме, его экзон-интронной структуры и спектра его мутаций. Такая информация на сегодняшний день доступна далеко не для всех моногенных болезней человека.

Косвенные методы ДНК-диагностики применяются в том случае, если ген, повреждение в котором приводит к заболеванию, не идентифицирован, а лишь локализован на определенной хромосоме, или когда методы прямой ДНК-диагностики не дают результата (например, при значительной протяженности и сложной молекулярной организации гена, а также широком спектре патологических мутаций в нем). Основной недостаток косвенных методов заключается в их не 100% точности. Возможная ошибка обусловлена вероятными рекомбинациями между изучаемым полиморфным локусом и повреждением в гене, кроме того, они могут быть применимы только для монолокусных заболеваний и неэффективны для моногенных полилокусных болезней. Главный недостаток косвенных методов – обязательное предварительное изучение генотипа как минимум одного пораженного родственника.

В современных условиях успешно практикуется комплексное использование и прямых и косвенных методов в каждом конкретном случае: подтверждение результатов косвенной диагностики результатами прямой, и наоборот. Такой подход позволяет получить наиболее точный и адекватный результат.

4. Цитогенетический метод.

Цитогенетический метод является основным методом медицинской генетики. Основным объектом цитогенетического метода являются субклеточные структуры, главным образом, хромосомы. Поэтому основой метода является микроскопическое изучение хромосом человека.

Цитогенетические исследования стали широко использоваться с начала 20-х годов ХХ века для изучения морфологии и подсчета хромосом человека, культивирования лейкоцитов для получения метафазных пластинок.

Изучение хромосом человека прошло три основных этапа:

1. поиск адекватных методических путей изучения морфологии хромосом, связано с именем таких биологов, как Навашин М.С., Андерс А.Г., Живаго П.И.

2. опубликование первой работы (Лежен, Тио Д.), в которой удалось получить картину морфологии хромосом человека и точно идентифицировать их число. В 1956 г. эти ученые первыми установили, что у человека 46, а не 48, как думали раньше, хромосом. И именно с ними связывают развитие современной цитогенетики. Это событие положило начало широкому изучению митотических и мейотических хромосом в норме и после воздействия мутагенов различной природы.

В 1956 г. Французские ученые Д. Лежен, Р. Тюрпен, и М. Готье установили хромосомную природу синдрома Дауна. В последующие годы были описаны многие часто встречающиеся у человека хромосомные болезни. Цитогенетика стала важнейшим разделом практической медицины. В настоящее время цитогенетический метод из многих др., является самым важным в выявлении наследственной (хромосомной) патологии, составления генетических карт хромосом, изучения мутационного процесса и др. С его помощью можно провести анализ материальных основ наследственности и кариотипа человека в норме и при патологии, изучить некоторые закономерности мутационного и эволюционного процесса. Все хромосомные болезни у человека были открыты этим методом. Он незаменим для дифференциальной диагностики многих врожденных и наследственных болезней. Овладеть им в условиях клинической лаборатории с соответствующим оборудованием несложно.

В 1960 году в Денвере была разработана первая Международная классификация хромосом человека (в настоящее время постепенно вытесняется). В ее основу легли размеры хромосом и положение первичной перетяжки – центромеры. А в 1971 г. На I Парижской конференции генетиков сделаны в дополнении к Денверовской классификации были представлены методы дифференциальной окраски хромосом, благодаря которым каждая хромосома приобретает свой неповторимый рисунок, что помогает точной идентификации. Это уже связывают с третьим этапом

3. начинается с разработки методов дифференциального окрашивания хромосом. В последние годы разработаны ДНК-зонды, с помощью которых можно оценить наличие или отсутствие определенного, даже очень маленького, сегмента в хромосоме.

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изучении их в метафазах митоза и профазе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток было достаточно высоко. Важнейшие цитологические работы выполнены на лимфоцитах периферической крови, поскольку культивирование лимфоцитов в течение 2-3 суток в присутствии фитогемагглютинина позволяет получить множество метафазных пластинок для хромосомного анализа. Для этого кровь помещают в специальную среду, которая содержит необходимые для роста клеток крови питательные вещества, и инкубируют в присутствии специальных веществ – митогенов, которые стимулируют лимфоциты к делению. Клетки растут в культуре в течение 72 часов, за это время лимфоциты проходят два митотических деления, после чего добавляют колхицин, который ингибирует процесс формирования нити ахроматинового веретена, и все делящиеся клетки останавливаются на стадии метафазы. Но препараты хромосом человека можно приготовить из любой полиферативно активной ткани (костного мозга, собственно соединительные ткани и др.).

Все цитогенетические методы можно разделить на прямые и непрямые. При прямом методе используют активно делящиеся клетки (обычно это косный мозг), из которых получают препараты хромосом, зафиксировав на стадии метафазы. Этот метод имеет весьма узкое применение, преимущественно в онкологии. При непрямом методе необходимо предварительное культивирование клеток (обычно это лимфоциы крови) в особой среде. Через определенный промежуток времени (обычно через 72 часа) культура подвергается действию колхицина, который останавливает процесс деления на стадии метафазы, когда хромосомы максимально спирализованы. Клетки фиксируют смесью спирта и уксусной кислоты и некоторыми другими химическими веществами (гипотоническим солевым раствором, метанол-уксусным фиксатором и др.), окрашивают и анализируют хромосомы под микроскопом. Важным этапом цитогенетического анализа является окраска полученных препаратов. Ее проводят следующими методами простой окраски, дифференциальными и флюоресцентными методами.

1. Простая окраска (сплошная или рутинным методом) обеспечивает групповую идентификацию хромосом. Используется она для количественного учета хромосомных аномалий при определении мутагенности среды (действия радиации, химических мутагенов и др.).

Методы дифференциального окрашивания начали применяться в медицинской практике в 70-е гг. ХХ века. Эти методы выявляют структурную разнородность хромосом по длине, что выражается в виде чередования светлых и темных полос (эу- и гетерохроматический районы).

Другими клетками, используемыми в цитогенетическом анализе, являются клетки кожи, клетки эмбриональных тканей, половых желез.

5. Иммуногенетический метод.

Одним из важных разделов современной генетики является иммуногенетика, которая изучает наследственную обусловленность факторов иммунитета, разнообразие и наследование тканевых антигенов и тканевую несовместимость. Иммуногенетика возникла в ХХ веке на основе изучения групповых факторов крови по АВО- и Rh-системам, лейкоцитарных и эритроцитарных антигенов, сывороточных глобулинов, гемоглобинов и др.

Установлено два основных пути, по которым протекают иммунные реакции в организме:

1. Гуморальный связан с синтезом в крови белковых молекул (иммуноглобулинов или антител). Антитела способны связываться с антигенами (чужеродными молекулами), нейтрализуя их вредное действие.

Гуморальные факторы включают циркулирующие белки, которые образуются в ответ на различные внешние и внутренние воздействия (ожоги, инфекции, злокачественные новообразования и др.). К специфическим гуморальным факторам относятся иммуноглобулины. Выделяют несколько классов иммуноглобулинов. Для их строения характерно наличие двух тяжелых и двух легких полипептидных цепей, соединенных между собой дисульфидными мостиками. Легкие цепи определяют генетические детерминанты, а тяжелые – специфичность самих иммуноглобулинов. Гуморальные факторы иммунитета и, прежде всего, иммуноглобулины в сыворотке и других биологических жидкостях являются важным маркером иммуногенетических и иммунологических сдвигов в организме.

2. Клеточный связан с появлением клеток, способных распознавать и уничтожать возбудителя болезни (клеточный иммунитет).

Клеточные факторы иммунитета включают лимфоциты, моноциты, макрофаги, гранулоциты. К зрелым лимфоцитам относятся Т-лимфоциты, которые составляют 60-80% лимфоцитов в периферической крови, в их состав входят Т-хелперы (усиливающие иммунный ответ), Т-супрессоры (подавляющие иммунный ответ) и Т-киллеры; В-лимфоциты, которые через целый ряд стадий продуцируют антитела, т.е. специфические иммуноглобулины. Практически В-лимфоциты в разные периоды существования в клетке являются звеньями гуморального иммунитета. Макрофаги захватывают и перерабатывают антигены для представления их Т-лимфоцитам и активации последних. Кроме того, функции макрофагов заключаются в повышении фагоцитарной активности, усилении метаболизма, увеличении экспрессии рецепторов клетки и др.

6. Биохимические методы диагностики наследственных болезней.

Характерные изменения биохимических показателей, выявляемые при той или иной наследственной патологии, служат постоянным, а иногда и единственным признаком заболевания. Кроме того, отклонения в биохимических параметрах, как правило, предшествуют возникновению клинических симптомов, и существенно не зависят от клинико-генетического полиморфизма, обусловливающего вариабельность заболевания по степени тяжести. Таким образом, биохимические параметры можно считать более информативным описанием фенотипа. Подтверждением этого являются биохимические показатели гетерозигот, значения которых часто занимают промежуточное положение между значениями у нормальных и патологических гомозигот: например, гетерозтготные носители рецессивного аллеля фенилкетонурии симптомов заболевания не имеют, но реагируют на введение фенилаланина более сильным повышением концентрации этой аминокислоты в плазме, чем нормальные гомозиготы. К тому же не для всех наследственных заболеваний обнаружен молекулярно-генетический дефект или имеются возможности для его выявления. Так, безусловно, биохим.методы играют первоочередную роль в диагностике наследственных нарушений обмена веществ. Например, при прогрессирующей дистрофии Дюшенна/Беккера повышается уровень креатинфосфокиназы (фермент мышц) в крови больных при начальной и развернутой стадии заболевания, а также и у 30% носительниц этого гена.

Предметом биохимической диагностики могут быть различные классы органических и неорганических веществ (аминокислоты, углеводы, липиды, мукополисахариды, ионы металла и др.) и их метаболиты, концентрация и и отклонения в активности ферментов. Универсальность биохимического метода состоит в том, что исследовать им можно любую ткань или секрет организма (мочу, пот, кровь, слюну и др.).

Для диагностики ряда состояний используют комбинированные биохимические методы. Так иммуно-генетическое тестирование позволяет поставить или уточнить диагноз при врожденных иммунодефицитных состояниях, при подозрении на антигенную несовместимость матери и плода по тем или иным системам групп крови. Иммуно-гистохимический метод используется для выявления той или иной белковой субстанции в какой-либо ткани при помощи специфических антител.

С каждым годом совершенствуясь, биохим.методы становятся все более сложными, многоступенчатыми, а следовательно, и дорогими.

Биохимические методы подразделяют на :

1. Качественные реакции позволяют обнаружить избыточные концентрации субстратов блокированной ферментной реакции или их производных, накапливающихся при наследственных нарушениях обмена веществ. Однако на результаты этих тестов влияет применение ряда лекарственных препаратов и их метаболитов, а также некоторых пищевых добавок. Наиболее распространенный тест с мочой.

2. Полуколичественные и количественные тесты проводятся как с мочой, так и с кровью. Допустим измерение концентрации того или иного вещества, а также определение кислотно-щелочного равновесия, что позволяет дальше планировать тактику диагностики.

7. Онтогенетический метод - это метод изучения действия генотипа в индивидуальном развитии человека. Существует ряд заболеваний, которые проявляют себя не только в гомозиготном рецессивном состоянии и даже будучи в гетерозиготном состоянии (эффект неполного доминирования). Онтогенетический метод позволяет выяснить, как действуют гены во времени. На определенном возрастном уровне в работу вступает определенная группа генов. Например, хорея Гентингтона не проявляется до 30 лет, после чего вступает доминантный ген. Или, например, протоонкогены присутствуют в геноме человека. Считается, что онкогенез – это болезнь старения, нормальный биологический процесс. Именно онтогенетический метод позволяет ответить на вопрос как наследуется признак: или он является фенокопией (собственно аномалия развития) или признак приобретает наследственный характер.