Выделение фага из объектов окружающей среды
Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал (вода, суспензия фекалий и др.) через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37 °С в течение 18 - 24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественными и количественными методами.
Качественный метод определения фагов e.Coli
Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37 °С в течение 10—15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.
Количественный метод - определение титра фага по методу Грациа
Для постановки опыта предварительно:
а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате;
б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3 - 4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10-2 - 10-7 в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (10-7) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выливают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45 0С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя.
Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10-6) с бактериями и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем - из разведения 10-5. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 370 С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризующая концентрацию фага, называется его титром (табл.1).[3]
Таблица 1. Результаты титрования фага но методу Грациа (форма протокола)
Определение спектра литического действия фага
Чашку с питательным агаром делят на квадраты по числу испытуемых бактериальных культур. На каждый квадрат петлей наносят каплю соответствующей бульонной культуры и распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. Затем на каждый засеянный квадрат петлей или пастеровской пипеткой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплошной лизис бактерий или так называемые стерильные пятна на бактериальном газоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.[3]
Фаготипирование бактерий
Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают на чашке те квадраты, в которых имеется сплошной лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис (рис. 6).
Рис.6. Постановка опыта фаготипирования культуры стафилококка.