- •Складні методи забарвлення бактерій
- •Забарвлення за Грамом
- •Мікроскопічне дослідження живих мікробів
- •Мікроскопічні методи дослідження мікроорганізмів
- •12 Частина і. Загальна мікробіологія
- •14 Частина і. Загальна мікробіологія
- •Правила роботи з імерсійною системою:
- •0,04 Мкм, тобто значно менші, ніж під звичайним світловим мікроскопом. Тому
- •5 Млн разів. За принципом дії розрізняють просвічуючі (трансмісивні), скануючі
- •18 Частина і. Загальна мікробіологія
Складні методи забарвлення бактерій
Складні (диференціюючі) методи забарвлення базуються на фізико-хімічних
особливостях будови мікробних клітин. Суть їх полягає у фарбуванні мазка двома
барвниками, один з яких є основним, другий – доповнюючим (контрастним). Після
дії першого барвника мазок знебарвлюють кислотою, лугом, спиртом або ацето-
ном. Деякі мікроорганізми легко, інші важко знебарвлюються. Одні з них є кислото-
і спиртостійкими, другі тільки кислотостійкими. Спори бактерій дуже важко підда-
ються дії знебарвлюючих речовин, вони водночас є і фарбостійкими об’єктами.
Складні методи забарвлення вживають для детального вивчення структури
бактерійних клітин, а також для характеристики і диференціації одних мікроор-
ганізмів від інших. Отже, вони мають важливе діагностичне значення. У лабора-
торній практиці найчастіше використовують складні методи Грама, Ціля-Нільсе-
на, Нейссера, Буррі-Гінса та ін.
Забарвлення за Грамом
Цей метод розробив Кристіан Грам у 1884 р. Серед складних методів фарбу-
вання він є найбільш універсальним. Він має важливе диференціально-діагнос-
тичне значення, оскільки допомагає визначати таксономічне положення тих чи
інших бактерій.
Особливості забарвлення за методом Грама дозволяють поділити всі мікро-
організми на дві групи: грампозитивні та грамнегативні, хоча в практиці трапля-
ються випадки, коли одні й ті ж бактерії характеризують як грамваріабельні.
Принцип методу полягає в тому, що клітини грампозитивних мікробів здатні
утворювати міцну сполуку з генціанвіолетом та йодом, яка не вимивається з бак-
терій спиртом, отже, вони забарвлюються в темно-фіолетовий колір. У грамнега-
тивних бактерій цей комплекс вимивається спиртом, тому вони потім забарвлю-
ються фуксином у червоний колір.
До грампозитивних відносяться стафілококи, стрептококи, бацили, клостридії,
дифтерійні та туберкульозні палички. Грамнегативними є нейсерії (менінго- і го-
Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів 33
нококи), кишкові палички, сальмонели, шигели, рикетсії, всі звивисті бактерії
(вібріони, спірили, спірохети, лептоспіри).
Механізм забарвлення за Грамом досить складний і ще остаточно не вивче-
ний. Грампозитивні бактерії мають товсту клітинну стінку, яка складається з 5-6
шарів пептидоглікану (муреїну) та полімерів тейхоєвих кислот. Ці структури лег-
ко сприймають і міцно утримують фарбуючий комплекс генціанвіолет + йод і при
дії спирту протягом 30-60 с не знебарвлюються. Грамнегативні бактерії мають
значно тоншу оболонку, що складається з 1-2 шарів петидоглікану, не містить тей-
хоєвих кислот, а, отже, не втримують комплекс основного барвника при знебарв-
ленні спиртом. При додатковій обробці мазка фуксином Пфейфера вони фарбу-
ються в червоний колір. Саме в цьому полягає основний механізм забарвлення за
методом Грама. Окрім того, різне забарвлення мікроорганізмів пов’язане з більш
високою концентрацією комплексу протеїн-рибонуклеїнату магнію в клітинах
грампозитивних бактерій, більш кислим значенням рH і різним співвідношенням
РНК:ДНК у цитоплазмі (у грампозитивних 8:1, а грамнегативних 1:1).
Виготовлення реактивів для забарвлення за Грамом. Найчастіше в лабораторії
готують такі барвники: 1) феноловий генціанвіолет, 2) розчин Люголя, 3) фуксин Пфейфе-
ра, 4) етанол 96°.
1. Феноловий генціанвіолет
Генціан фіолетовий 1 г
Фенол кристалічний 2 г
Етанол 96° 10 мл
Вода дистильована 100 мл
Феноловий генціанвіолет готують так само, як і феноловий фуксин Циля. Генціан
фіолетовий можна замінити кристалвіолетом, або водним розчином метилвіолету, який є
досить стійким. Його готують за таким прописом:
метиловий фіолетовий 0,2 г
вода дистильована 100 мл
2. Розчин Люголя
Йодид калію 2 г
Йод кристалічний 1 г
Вода дистильована 300 мл
Спочатку йодид калію розчиняють у невеликій кількості води, потім всипають крис-
талічний _________йод, після розчинення якого добавляють дистильовану воду до 300 мл.
3. Фуксин Пфейфера готують із концентрованого фенолового розчину цього барв-
ника, розводячи його в 10 разів дистильованою водою. Необхідно використовувати лише
свіжовиготовлений барвник.
Техніка забарвлення. Найбільш поширений, так званий стандартний спосіб
забарвлення за Грамом, проходить у декілька етапів:
1. На фіксований жаром мазок кладуть трохи коротшу і вужчу від предметно-
го скла смужку фільтрувального паперу. Зверху на неї наносять достатню кількість
34 Частина І. Загальна мікробіологія
розчину генціанвіолету (основний барвник) на 1-2 хв, зливають його і знімають
папірець.
2. Після прополоскування мазка водою наносять розчин Люголя на 1-2 хв (до
сильного потемніння препарату).
3. Зливають розчин Люголя і, не промиваючи мазок, знебарвлюють його 96°
етанолом протягом 30-60 с (до відходження сіро-фіолетових струмочків фарби).
4. Препарат ретельно промивають водою і додатково забарвлюють фуксином
Пфейфера (доповнюючий контрастний барвник) протягом 2 хв.
5. Мазок промивають водою, висушують, наносять краплю кедрової олії,
мікроскопують з імерсійним об’єктивом.
Мікроскопічна картина: при правильному забарвленні грампозитивні мікро-
організми фарбуються в темно-фіолетовий колір, грамнегативні бактерії, ткани-
ни, клітини органів – у рожевий (див. вкл., рис. 1).
Запропоновано ряд модифікацій цього методу, з яких найпоширенішим є ва-
ріант Синьова. Він полягає в тому, що замість розчину генціанвіолету (метилвіо-
лету, кристалвіолету) використовують смужки фільтрувального паперу заздалегідь
просочені одним із вказаних барвників і висушені. При забарвленні за Синьовим
на мазок наносять декілька крапель води, опускають і притискають пінцетом до
скла просочену фарбою смужку паперу. Через 2 хв її знімають. Наступні етапи
забарвлення такі самі, як і при стандартному методі Грама. Модифікація Синьова
особливо зручна для використання на практичних заняттях та в похідних лабора-
торіях. Вона дає значну економію барвника.
Забарвлення кислотостійких бактерій. Кислотостійкі мікроорганізми (збуд-
ники туберкульозу, прокази, актиноміцети та ін.) містять велику кількість високо-
молекулярних ліпідів, восків і міколової кислоти. Вони важко фарбуються зви-
чайними аніліновими барвниками. Але при забарвленні їх концентрованим фено-
ловим фуксином Циля з підігріванням міцно утримують його і не знебарвлюються
розчинами кислот, лугів і спиртів. Клітини тканин, лейкоцити, слиз, інші бактерії
при такій обробці легко віддають барвник. У зв’язку з цим при додатковому забарв-
ленні препаратів метиленовою синькою всі ці елементи після знебарвлення мазків
фарбуються в синій колір, а кислотостійкі бактерії залишаються червоними.
Метод Циля-Нільсена. Остаточний варіант методу автори запропонували в
1884 р. Техніка забарвлення включає декілька етапів:
1. На фіксований у полум’ї мазок із харкотиння хворого кладуть смужку
фільтрувального паперу, наливають на нього фуксин Циля і забарвлюють, тричі
підігріваючи до появи парів (але не доводячи до кипіння), після чого препарат із
фарбою залишають ще на 1-2 хв для охолодження; зливають барвник, знімають
папірець, промивають водою.
2. Препарат знебарвлюють 5 % сірчаною або соляною кислотою до появи
жовтуватого відтінку (10-30 с) і декілька разів промивають водою.
3. Додатково забарвлюють мазок метиленовою синькою Леффлера, промива-
ють водою, висушують і досліджують під мікроскопом.
Мікроскопічна картина: на загальному синьому (голубому) фоні кислотостійкі
бактерії виглядають рубіново-червоними (див. вкл., рис. 2).
Розділ 3. Морфологія мікроорганізмів 35
Щоб відрізнити палички туберкульозу від збудника прокази використовують
метод Семеновича-Марциновського: спочатку мазок забарвлюють втричі розве-
деним фуксином Циля протягом 2 хв, промивають водою і додатково фарбують
метиленовим синім 5 хв. При цьому туберкульозні палички взагалі не сприйма-
ють забарвлення, а збудник прокази набуває червоного кольору.
При забарвленні кислотостійких бактерій замість класичного методу Циля-
Нільсена дуже зручно користуватися його модифікацією за Синьовим.
Фільтрувальний папір просочують концентрованим розчином фуксину Циля,
висушують, нарізають на смужки розміром з предметне скло і зберігають у
герметично закритій банці. На фіксований мазок наносять декілька крапель дис-
тильованої води, накладають зафарбовану смужку паперу, тричі нагрівають до
появи парів. Далі продовжують забарвлення так само, як і за оригінальним мето-
дом Циля-Нільсена.
Забарвлення за Романовським-Гімзою є одним із основних і найпоширені-
ших методів забарвлення мазків крові в гематології. За цим способом добре фар-
буються різні структурні елементи паразитів крові – малярійних плазмодіїв, три-
паносом, лейшманій. Його також часто застосовують для виявлення токсоплазм,
спірохет, рикетсій, личинок нематод тощо.
Поліхромний барвник Гімзи складається з азура, еозину й метиленового си-
нього. Краще вживати готовий його розчин фабричного виробництва. Безпосе-
редньо перед вживанням стандартний розчин розводять дистильованою водою
нейтральної або слабко лужної реакції (рН 7,0-7,2) із розрахунку 1-2 краплі барв-
ника на 1 мл води. Препарати-мазки фіксують метанолом протягом 3-5 хв і вису-
шують на повітрі. Приготований розчин наносять на мазок, а ще краще предметне
скельце з мазком опускають у склянку з барвником. Забарвлення триває від 30 хв
до двох і більше годин. Товсті краплі крові фарбують протягом 30 хв. Потім барвник
зливають, препарати промивають водою і добре висушують на повітрі у вертикаль-
ному положенні. Мікроскопію проводять із використанням імерсійних об’єктивів.
Будучи в розчині синьо-фіолетовим, поліхромний барвник Романовського-
Гімзи фарбує цитоплазму в голубий колір, а ядра клітин, тіла бактерій, їх капсули,
слиз – у червоно-фіолетовий. У дифтерійних паличок ядерні елементи забарвлю-
ються в темний червоно-фіолетовий колір, а волютинові зерна – у вишнево-черво-
ний; цитоплазма має рожевий колір.__