19. Определение белка (офс 42-0053-07)

Определение содержания белка проводят в лекарственных средствах, выделенных из природных источников или полученных биотехнологическими методами.

Для лекарственных средств, в которых белки не являются основными компонентами или имеют необычную первичную структуру (например, протамины), могут использоваться модифицированные методики определения белка, указанные в частных фармакопейных статьях, в которых могут быть изменены рекомендуемые области концентраций белка и/или объемы испытуемого раствора и реактивов и некоторые другие условия в соответствии с индивидуальными свойствами лекарственного средства.

Для количественного определения белка используют следующие методы:

1. Спектрофотометрические методы, в которых измерение проводят при одной длине волны (метод А) или при двух длинах волн (метод Б). Спектрофотометрические методы определения белка основаны на измерении светопоглощения растворов белков при 280 нм (поглощение ароматических аминокислот) или в области 205-220 нм (поглощение пептидных групп).

2. Колориметрические методы

1. Метод с биуретовым реактивом. Метод универсален, мало зависит от природы белка, но имеет низкую чувствительность.

2. Метод Лоури. Преимущественно используется для ферментных препаратов. Отличается высокой чувствительностью, но определению мешают многие вещества. В последнем случае применяют метод с предварительным осаждением белка (Б). Зависимость поглощения белка от его концентрации нелинейная, однако, в области малых концентраций ее можно считать линейной. Определение проводят по калибровочному графику, построенному по растворам стандартного образца белка, который воспроизводят при каждом анализе.

3. Метод Бредфорда используется для белков и пептидов с молекулярной массой более 3000 Да. Метод имеет высокую чувствительность, но степень связывания красителя в значительной степени зависит от индивидуальных свойств белка.

4. Метод с бицинхониновой кислотой альтернативен методу Лоури, но отличается более высокой стабильностью реагента, чем реактив Фолина, и меньшей зависимостью от природы белка и сопутствующих соединений.

Колориметрические и некоторые спектрофотометрические методы требуют использования стандартного образца. В качестве стандартного образца белка используют: стандартный образец присутствующего в препарате белка, или бычий сывороточный альбумин, или сывороточный альбумин человека, высушенные перед испытанием до постоянной массы (стандартный образец и условия высушивания указывают в частной фармакопейной статье: в эксикаторе под вакуумом над фосфора(V) оксидом, в вакуумном шкафу при 60 град. C или в термостате при 100-105 град. C).

Раствор стандартного образца. Стандартный образец белка растворяют в том же растворителе и в той же концентрации, что и в испытуемом растворе.

Испытуемый раствор. Растворяют или разводят лекарственное средство в воде, 0,9% растворе натрия хлорида или буферном растворе до концентрации, указанной в частной фармакопейной статье.

3. Методы определения белка по содержанию азота

1. Метод Къельдаля - титриметрический (А - микрометод, Б - обратное титрование).

2. Метод с реактивом Несслера (колориметрический). В качестве стандартного образца, содержащего азот, используют аммония сульфат.

Для многокомпонентных препаратов, содержащих другие вещества, в состав которых входит азот, перед определением белка необходимо предварительно проводить пробоподготовку: осаждение трихлоруксусной или фосфорновольфрамовой кислотой.

4. Метод определения белка по аминокислотному составу.