Загальна характеристика роботи
Актуальність роботи. Останніми роками мікробні поверхнево-активні речовини (ПАР) є об’єктом інтенсивних теоретичних і прикладних досліджень, що зумовлене їх можливим практичним використанням у різних галузях промисловості, а також у природоохоронних технологіях для очищення довкілля. Перевагами мікробних ПАР порівняно з хімічними аналогами є біодеградабельність, нетоксичність, постійність фізико-хімічних властивостей у широкому діапазоні рН і температури [Singh, 2007].
Раніше на кафедрі біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій із забруднених нафтою зразків води і ґрунту було виділено штам нафтоокиснювальних бактерій, ідентифікований як Nocardia vaccinii K-8 [Пирог, 2005]. Цей штам характеризувався здатністю до асиміляції вуглеводневих субстратів (нафта, рідкі парафіни, гексадекан), причому ступінь утилізації цих гідрофобних сполук підвищувався у разі іммобілізації бактеріальних клітин. Встановлено можливість очищення забрудненої нафтою води (ступінь очищення 99,5–99,8 %) на модельній установці з іммобілізованими на керамзиті клітинами N. vaccinii K-8 за високої швидкості подачі води та в умовах низької аерації.
Відомо, що здатність до асиміляції вуглеводневих субстратів у мікроорганізмів часто зумовлена синтезом поверхнево-активних речовин. Разом з тим значним недоліком, який стримує широкомасштабне виробництво мікробних ПАР, є висока собівартість цих продуктів мікробного синтезу [Banat, 2010]. Одним з потенційних шляхів підвищення ефективності технологій мікробних ПАР є використання дешевих ростових субстратів (продуктів переробки основної сировини або відходів різних галузей промисловості). На теперішній час одним з найперспективніших субстратів для використання у біотехнологічних процесах є гліцерин – побічний продукт, утворюваний у великих кількостях при виробництві біодизелю з рослинної і тваринної сировини [Silva, 2010]. Так, під час одержання 100 дм3 біодизелю утворюється (як продукт трансетерифікації рослинних олій і тваринних жирів) до 10 дм3 гліцерину. Неможливість використання в інших технологіях такої величезної кількості гліцерину є на теперішній час найважливішим фактором, що стримує виробництво біодизелю у світі. Одним із шляхів утилізації гліцерину може бути використання його як джерела вуглецю і енергії при розробці технологій мікробного синтезу практично цінних метаболітів.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота включає дослідження, виконані згідно плану науково-дослідних робіт кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій за темою «Розробка високоефективних ресурсозберігаючих біотехнологій з метою їх впровадження у мікробіологічну, фармацевтичну та харчову промисловість» (2006–2010, 2011–2015 рр.), а також у рамках фундаментального дослідження за рахунок видатків загального фонду державного бюджету «Розробка наукових основ регуляції синтезу і фізико-хімічних властивостей мікробних сурфактантів мультифункціонального призначення» (2010–2012 рр.), № державної реєстрації 0109U008586.
Мета і задачі дослідження. Мета роботи – розробка шляхів інтенсифікації синтезу поверхнево-активних речовин за умов росту N. vaccinii K-8 на різних вуглецевих субстратах та дослідження їх практичного використання.
Для виконання роботи необхідно вирішити такі завдання:
дослідити здатність до синтезу ПАР під час культивування N. vaccinii K-8 на гідрофобних і гідрофільних субстратах;
встановити оптимальні умови синтезу ПАР у процесі вирощування N. vaccinii K-8 на гліцерині;
визначити хімічний склад ПАР, синтезованих N. vaccinii K-8 в оптимальних умовах;
дослідити можливість підвищення синтезу ПАР N. vaccinii K-8 на гліцерині за присутності екзогенних попередників;
розробити технологічну схему біосинтезу ПАР N. vaccinii K-8;
дослідити біодеградабельність ПАР N. vaccinii K-8 та їх вплив на деструкцію нафтових забруднень;
визначити антимікробні властивості ПАР N. vaccinii K-8.
Об’єкт дослідження – N. vaccinii K-8 та мікробні поверхнево-активні речовини.
Предмет дослідження – процес синтезу мікробних поверхнево-активних речовин, очищення води і ґрунту від нафтових забруднень, антимікробна дія ПАР.
Методи дослідження. Під час виконання дисертаційної роботи використовували такі методи досліджень: мікробіологічні (визначення морфолого-культуральних ознак бактерій, антимікробних властивостей, біодеградабельності ПАР та кількості життєздатних мікробних клітин); біотехнологічні (культивування мікроорганізмів, дослідження ефективності біодеструкції); фізико-хімічні методи (визначення поверхневого натягу, концентрації ПАР і біомаси, індексу емульгування, рН, концентрації нафти у воді, ґрунті та піску); хімічні (визначення хімічного складу ПАР методом тонкошарової хроматографії); математичні методи (оптимізація поживного середовища методом повного факторного експерименту та статистична обробка результатів досліджень).
Наукова новизна одержаних результатів. Селекціоновано N. vaccinii K-8 – продуцент позаклітинних метаболітів з поверхнево-активними та емульгувальними властивостями. Вперше встановлено здатність бактерій роду Nocardia до синтезу ПАР на етанолі та гліцерині.
Встановлено, що найвищі значення синтезу ПАР за умов росту N. vaccinii K-8 на гліцерині спостерігаються за використання нітрату натрію як джерела азотного живлення і посівного матеріалу, вирощеного до середини експоненційної фази росту на середовищі з дріжджовим екстрактом і сульфатом заліза.
Встановлено, що за хімічним складом позаклітинні поверхнево-активні речовини штаму К-8 є комплексом нейтральних, аміно- та гліколіпідів. Нейтральні ліпіди представлені міколовими і n-алкановими кислотами, гліколіпіди – трегалозодіацелатами і трегалозоміколатами. Вперше встановлено здатність бактерій роду Nocardia до синтезу позаклітинних трегалозоміколатів. Показано можливість підвищення на 40 % умовної концентрації ПАР у разі внесення на початку стаціонарної фази росту N. vaccinii K-8 у середовище з гліцерином 0,1 % фумарату (попередник глюконеогенезу) і 0,1 % цитрату (регулятор синтезу ліпідів).
Встановлено здатність мікроорганізмів різних таксономічних груп асимілювати ПАР N. vaccinii K-8 як єдине джерело вуглецю та енергії. Показано, що штам K-8 не здатен використовувати власні ПАР як джерело вуглецевого живлення.
Практичне значення одержаних результатів. За допомогою математичних методів планування експерименту оптимізовано поживне середовище для культивування N. vaccinii K-8 і встановлено можливість збільшення у 2–4 рази (до 12,6 г/дм3) концентрації синтезованих на гліцерині ПАР порівняно з показниками до оптимізації.
Розроблена технологія синтезу ПАР N. vaccinii K-8 порівняно з відомими у світі на основі гліцерину має такі переваги: по-перше, вища концентрація синтезованих позаклітинних ПАР; по-друге, вищий вихід ПАР від заданого субстрату (штам К-8 синтезує 12,6 г/дм3 ПАР з 1,5 % гліцерину, у той час як інші продуценти від 3 до 8 г/дм3 ПАР з 2–10 % субстрату).
Встановлено, що використання як біоциду формаліну у концентрації 0,5 % дає змогу подовжити до 30 діб термін зберігання ПАР N. vaccinii K-8 без значної втрати їх поверхнево-активних властивостей.
Показано можливість використання суспензії клітин N. vaccinii K-8 і препаратів ПАР у вигляді постферментаційної культуральної рідини для ефективної (до 98 %) деструкції нафтових забруднень у воді (2,6 г/дм3) і ґрунті (20 г/кг).
Встановлено антимікробну щодо фітопатогенних бактерій активність позаклітинних метаболітів N. vaccinii K-8, що засвідчує перспективність їх використання для розробки екологічно безпечних препаратів для контролю чисельності фітопатогенів.
Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Дисертантом проведено експериментальні дослідження, проаналізовано наукову літературу з даної проблеми, узагальнено отримані експериментальні дані, проведено порівняльний аналіз з існуючими літературними даними. Автором особисто встановлена можливість синтезу метаболітів з поверхнево-активними та емульгувальними властивостями під час культивування N. vaccinii К-8 на гідрофобних та гідрофільних субстратах, підібрано умови культивування, визначено показники росту і синтезу поверхнево-активних речовин (умовну концентрацію ПАР, поверхневий натяг, індекс емульгування); встановлено здатність до біодеструкції нафтових забруднень і антимікробні властивості поверхнево-активних речовин N. vaccinii K-8.
Планування основних напрямів і результатів роботи, підготовка публікацій за результатами досліджень проходило за безпосередньої участі наукового керівника д.б.н., проф. Пирог Т.П.
Визначення хімічного складу здійснювали спільно з завідувачем лабораторією кафедри біотехнології і мікробіології Антонюк С.І. і асистентом цієї ж кафедри Конон А.Д. (Національний університет харчових технологій), які є співавторами наукових публікацій.
Гриценко Н.А. є лауреатом Третьої премії конкурсу на кращу наукову роботу на тему «Зробимо Україну енергоощадною», проведеного Інститутом стратегічних оцінок при Президентському фонді Леоніда Кучми (2010 р.).
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на ІV, V і VІІ Міжнародній науково-технічній конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ в біології» (Львів, 2008, 2009, 2011), 12-й і 15-й Міжнародній школі-конференції молодих вчених «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2008, 2011), Х Міжнародній конференції молодих вчених «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009), ХІІ з’їзді Товариства мікробіологів України (Ужгород, 2009), Ukrainian-Hungarian Days for the Extending of the Bilateral Cooperation (Uzhgorod, 2009), Міжнародній науковій конференції «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2010), Міжнародній науково-практичній конференції «Регионы в условиях неустойчивого развития» (Шарья, 2010), XVIII Міжнародній науково-технічній конференції «Екологічна і техногенна безпека. Охорона водного і повітряного басейнів. Утилізація відходів» (Бердянськ, 2010), VII Національному з’їзді фармацевтів України (Харків, 2010), Х Українському біохімічному з’їзді (Одеса, 2010), Міжнародній науково-практичній конференції «Новітні технології, обладнання, безпека та якість харчових продуктів: сьогодення та перспективи» (Київ, 2010), конференції молодих вчених «Биология растений и биотехнология» (Біла Церква, 2011), V Міжнародній науково-технічній конференції студентів, аспірантів, молодих вчених «Хімія та сучасні технології» (Дніпропетровськ, 2011 р.), Всеукраїнській науковій конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2011 р.), V Міжнародній конференції молодих вчених «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» (Odesa, 2011), Міжнародній конференції «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology, pharmacology, medicine» (Санкт-Петербург, 2011), 5-й Всеросійській науково-практичній конференції «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2011), I Міжнародній науково-практичній конференції «Актуальные вопросы науки» (Москва, 2011), IV Міжнародній науково-практичній конференції «Экологические проблемы природных и урбанизированных территорий» (Астрахань, 2011), II Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених «Геоэкология и рациональное природоиспользование: от науки к практике» (Белгород, 2011).
Публікації. За результатами наукових досліджень опубліковано 49 наукових праць, із них – 4 статті у фахових виданнях, 1 стаття у журналі бази SCOPUS та 44 тези доповідей.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 149 сторінках машинописного тексту і складається з таких структурних частин: «Вступ», «Огляд літератури» (2 розділи), «Результати досліджень» (4 розділи), «Обговорення», «Висновки», «Список використаних джерел», який містить 168 посилань (з них 98 іноземних авторів). Робота містить 37 таблиць та 12 рисунків.