Санитарно-микробиологическое исследование воздуха

Цель занятия. Ознакомить студентов с микрофлорой воздуха, источниками ее загрязнения патогенной микрофлорой. Студенты должны овладеть методами бактериологического исследования воздуха - методами Коха и Кротова.

Материальное оснащение. Для исследования воздуха: аппарат Кротова, чашки Петри с МПА и средой Чапека, спирт для обработки внутренней поверхности аппарата Кротова.

Воздух является неблагоприятной средой для размножения микроорганизмов. Отсутствие питательных веществ, солнечные лучи и высушивание обусловливают быструю гибель микроорганизмов в воздухе, поэтому микрофлора воздуха не так обильна, как микрофлора почвы и воды.

Состав микрофлоры воздуха очень разнообразен, там встречаются пигментные сапрофитные бактерии (микрококки, сарцины), споровые палочки, плесневые грибы и дрожжи. Доказано что в 1 м³ воздуха животноводческих помещений находится до 2 млн. микробов, в том числе и патогенных. Патогенные микроорганизмы попадают в воздух при кашле, отфыркивании и чихании. При этом капли аэрозоли, находящиеся в воздухе, служат источником аэрогенного заражения окружающих. Скорость оседания капель зависит от диаметра аэрозоля.

Бактериальные аэрозоли делят на три фазы. 1. Крупнокапельная фаза с диаметром частиц аэрозоля более 0,1 мм; длительность пребывания таких частиц в воздухе – несколько секунд, капли быстро оседают. 2. Капельно-ядерная фаза, имеющая диаметр частиц 0,1 мм и менее. Частицы длительно находятся в воздухе и рассеиваются на большие расстояния с потоками воздуха. С ней рассеиваются различные микроорганизмы, в том числе и патогенные. 3. Фаза бактериальной пыли имеет частицы разного диаметра от 1 мм до 0,001 мм. Эта фаза имеет наибольшее эпизоотологическое и эпидемиологическое значение, т.к. она длительно находится во взвешенном состоянии и глубоко проникает в дыхательные пути. Аэрогенным путем инфекционные заболевания передаются, главным образом, в закрытых помещениях.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха проводят для определения количества МАФАнМ (мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов) в 1 м³ и качественного состава (наличие санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов). МАФАнМ в воздухе определяют посевом на поверхность МПА, а количество санитарно-показательных микробов (стафилококков и стрептококков) определяют посевом на кровяной и желточно-солевой агар. Для определения наличия плесневых грибов и дрожжей применяют среды Сабуро и Чапека.

Существует много методов бактериологического исследования воздуха. Самыми доступными и чаще применяемыми являются методы Коха и Кротова.

Седиментационный метод Коха. Суть метода заключается в осаждении микробных частиц и капель аэрозоли на поверхность плотной питательной среды под действием силы тяжести.

Методика: чашки Петри с МПА и средой Сабуро оставляют открытыми на 5-20 мин в классе, в цехах молочного завода, мясокомбината (время экспозиции зависит от предполагаемой загрязненности). Чашки закрывают и помещают в термостат при 30⁰С, если это МПА или кровяной агар, их культивируют в течение 48 часов; если это среда Сабуро – культивирование проводят при 25⁰С в течение 4-7 суток. Затем проводят подсчет выросших колоний бактерий и плесневых грибов во всей чашке.

После подсчета выросших колоний в чашке Петри, определяют количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха по формуле Омелянского, согласно которой предполагается (т.е. это не точный метод), что в чашки с питательной средой площадью 100 см², в течение 5 мин оседает столько микробных клеток, сколько их содержится в 10 л воздуха. Для определения количества бактерий в 1м³ воздуха применяют формулу Омелянского:

А . 100 . 1000 . 5

Х = --------------------

в . 10 . Т

где Х – количество микробов в 1 м³ (1000 л) воздуха;

А – число колоний выросших на МПА в чашках;

в – площадь чашки (78 см²);

5 – время экспозиции по правилу Омелянского;

Т – время, в течение которого чашка была открыта;

10 –10 л воздуха по правилу Омелянского;

1000 – 1 м³ воздуха;

100 - 100 см² питательной среды.

Аспирационный метод микробиологического исследования воздуха с применением прибора Кротова основан на использовании ударного действия воздушной струи, протянутой через щель прибора, на поверхность МПА в чашках Петри. Этот метод является более точным, т.к. прибор снабжен микроманометром (или ротаметром), показывающим количество литров посеянного воздуха. Аппарат Кротова – это цилиндрический прибор, внутри которого имеется электромотор с центробежным вентилятором. При вращении вентилятора воздух засасывается из исследуемого помещения через узкую клиновидную щель в крышке прибора. Под крышкой прибора находится вращающаяся платформа с открытой чашкой Петри, струя воздуха ударяется о поверхность питательной среды, на которую оседают микроорганизмы из воздуха. Чашки с посевами помещают в термостат на 24-48 ч при 30⁰С, затем подсчитывают количество колоний в чашке и по формуле определяют число микробов в 1м³ воздуха исследуемого помещения:

а . 1000

Х = -----------

в

где Х – число микробов в 1 м³ (1000 л) воздуха;

а - число колоний, выросших на МПА в чашках;

1000 л = 1 м³ воздуха;

в - количество литров воздуха, пропущенного через щель прибора.

Таблица 1

Микробиологические нормативы санитарного состояния воздуха

производственных помещений (исследуют 1 раз в месяц)

Метод исследования	МАФАнМ, КОЕ. Не более	Плесневые грибы, КОЕ. Не более
1	2	3
Метод Кротова	150 колоний в 100 л	15 колоний в 100 л
Метод Коха	200 колоний за 20 мин	20 колоний за 20 мин

Задание для самостоятельной работы

1. Провести посев воздуха класса в чашки с МПА методом Коха для определения количества МАФАнМ.

2. Провести посев воздуха класса методом Кротова для определения количества МАФАнМ. Чашки с посевами поставить в термостат.

3. На следующем занятии провести подсчет выросших колоний и определить количество МАФАнМ в 1 м³ воздуха.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы

Цель занятия. Ознакомить студентов с микрофлорой почвы, источниками ее загрязнения патогенной микрофлорой. Студенты должны овладеть различными методами бактериологического исследования почвы.

Материальное оснащение: образцы почвы в пакетиках по 1 г, стерильный физраствор по 9 мл в пробирках, стерильные пипетки по 1 мл, стерильные чашки Петри, расплавленный МПА в пробирках столбиком, пробирки со средой Кесслера , агар Эндо в чашках Петри.

Почва является естественной средой обитания многих видов микроорганизмов. В ней имеются все условия для благоприятного их развития: достаточное количество влаги, органических и минеральных веществ. Почвенные микроорганизмы участвуют в минерализации органических отбросов, самоочищении почвы, в круговороте веществ в природе.

В почву с выделениями больных, а также с трупами животных, погибших от инфекционных болезней, со сточными водами попадают патогенные микроорганизмы. В связи с этим почва может служить источником распространения возбудителей инфекционных болезней, через почву загрязняются объекты окружающей среды, может происходить обсеменение сапрофитными и болезнетворными микроорганизмами сырья животного происхождения, пищевых продуктов, кормов.

В составе микрофлоры почвы принято выделять так называемые физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах и на разных этапах постепенного разложения органических веществ, к которым относятся:

1. Аммонификаторы, являющиеся гнилостными микроорганизмами, вызывающими гниение остатков растений, трупов животных, разложение мочевины (Bac. subtilis, Bac.mesentericus, S.marcescens, Proteus, грибы рода Aspergillus, Penicillium; анаэробы - Cl.sporogenes Cl.perfringens).

2. Нитрифицирующие бактерии;

3. Азотфиксирующие – клубеньковые и свободноживущие азотфиксирующие бактерии обладают исключительной способностью усваивать из воздуха атмосферный азот и в процессе жизнедеятельности образуют из молекулярного азота белки и другие органические соединения азота, которые используются растениями.

4. Бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожения, наблюдаемые при разложении микробами органических соединений углерода (молочнокислое, спиртовое, масляное, уксусное, пропионовокислое, ацетонобутиловое и др.).

5. Бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора.

На сроки выживания патогенных бактерий в почве оказывают влияние многие факторы: тип почвы, температура, воздействие окружающий экологии.

К первой группе патогенных микроорганизмов относятся клостридии Cl.perfringens, Cl.botulinum, которые образуют споры и могут попасть с остатками земли в силосуемую массу.

Вторая группа включает спорообразующие патогенные микроорганизмы (возбудители сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены), почва для них является вторичным резервуаром, поскольку при благоприятных условиях они могут размножаться и сохраняться в почве длительное время в виде спор. Например, палочки сибирской язвы оказались способными вегетировать в почве при 12⁰ С, достаточной влажности и наличии гумуса и микроэлементов.

В третью группу включены патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделениями животных и человека и сохраняющиеся там, в течение нескольких недель или месяцев. Все эти микроорганизмы – сальмонеллы, бруцеллы, микобактерии, лептоспиры и т.д. не образуют спор и поэтому быстро гибнут, в результате воздействия различных физических и химических факторов.

В почве обитает много плесневых грибов, некоторые из них, например, грибы из рода Фузариум, Стахиботрис, попадая на злаковые и другие растения, в процессе своего развития, вырабатывают токсические вещества, особенно во время зимовки на полях.

Микробы, для которых почва является природным биотопом	Микробы, попадающие в почву с выделениями животных и человека
	Сохраняющиеся долго	Сохраняющиеся сравнительно недолго
Клостридии ботулизма Возбудители глубоких микозов. Актиномицеты Некоторые возбудители Микотоксикозов.	Бациллы сибирской язвы. Клостридии столбняка. Клостридии анаэробных инфекций.	Сальмонеллы, шигеллы, вибрионы, бруцеллы. Возбудители туляремии, туберкулеза,лептоспироза. Возбудитель сапа, Вирус ящура, энтеровирусы.

Обычно ограничиваются определением следующих показателей в почве:

- количество МАФАнМ в 1 г;

- коли-титра почвы;

- в отдельных случаях в почве определяют наличие возбудителей сибирской язвы (например, при строительстве детских лагерей, новых животноводческих помещений).

Отбор проб почвы. На обследуемой территории до 1000 м³ выделяют два участка по 25 м² каждый: один участок выбирают вблизи, другой – вдали от источника загрязнения. С каждого участка отбирают среднюю пробу, составленную из 5 образцов, взятых по диагонали. Образцы берут на глубине до 20 см, при исследовании почвы скотомогильников – ниже глубины захоронения не менее чем на 25 см. Пробы отбирают стерильным железным совком или специальным буром в стерильные широкогорлые банки, которые закрывают ватными пробками. К банке приклеивают этикетку с датой и номером отобранной почвы.

Масса каждого образца должна быть 200-300 г, а смешанного – не менее 1 кг. Отобранные пробы почвы направляют в лабораторию и исследуют сразу же или не позднее, чем через 12-18 ч при хранении в холодильнике.

Определение МАФАнМ в 1 г почвы методом серийных разведений

Для приготовления первого разведения 1:10 в колбу емкостью 500 мл наливают 270 мл стерильной водопроводной воды, куда добавляют 30 г исследуемой почвы. Колбу встряхивают несколько минут и отстаивают для оседания тяжелых частиц, микроорганизмы останутся в верхнем прозрачном слое.

Но в условиях учебного класса обычно 1 г почвы вносят в 10 мл стерильной воды, из полученного разведения почвы 1:10^-1 готовят последующие десятикратные разведения: для чистых почв до 1:10^-4, для загрязненных – до 1:10^-6 - 1:10^-9.

Из двух последних разведений почвы берут по 1 мл и переносят в стерильные чашки Петри (не менее двух чашек на каждое разведение), которые заливают 15 мл охлажденного до 50⁰С МПА и тщательно перемешивают, (этот метод называется «метод горячих заливок»). Посевы культивируют в термостате 24-48 ч при 30⁰С.

Учет результатов проводят путем подсчета выросших колоний в чашках Петри и определения среднеарифметического числа. Полученное число колоний умножают на степень разведения исследуемой почвы и получают число бактерий в 1 г почвы. Обычно в 1 г огородной почвы количество бактерий достигает 1-3 млрд.

Определение коли-титра почвы методом бродильных проб с использованием среды Кесслера. Исследования проводят в три этапа. На первом этапе готовят разведения: для чистых почв от 1:10^-1 до 1:10^-3; для загрязненных – от 1:10^-3 до 1:10^-9. После тщательного перемешивания полученной суспензии из различных разведений по 1 мл переносят в пробирки с 9 мл среды Кесслера с поплавками. Посевы культивируют при 43⁰С в течение 48 часов (при такой температуре дает рост кишечная палочка только теплокровных).

На втором этапе исследования просматривают посевы на среде Кесслера. Из проросших пробирок с наличием газа делают высев на поверхность агара Эндо в чашках Петри по секторам (4), с таким расчетом, чтобы выросли изолированные колонии. Посевы культивируют при 37⁰С в течение 24 ч.

На третьем этапе исследуют колонии, выросшие на среде Эндо. Для этого отмечают и отбирают колонии, типичные для бактерий БГКП, готовят из них мазки, красят по Граму, микроскопируют. При обнаружении в мазках коротких грамотрицательных палочек проводят высев из этих колоний на среду Кесслера для подтверждения газообразования в чистой культуре. В таблице 2 приведены санитарно-микробиологические показатели почвы.

Таблица 2

Микробиологические нормативы санитарного состояния почвы

Оценка почвы	МАФАнМ, КОЕ, не более	Коли-титр почвы
Относительно чистая	Менее 10 тысяч	Выше 1,0
Умеренно загрязненная	Сотни тысяч	1,0 - 0,01
Сильно загрязненная	Миллионы	0,01 - 0,001

Особую трудность представляет выделение сибиреязвенных спор из почвы, так как в ней находится огромное количество различных микроорганизмов, в том числе спорообразующих сапрофитных аэробов (Bac.subtilis - сенная палочка, Bac.mesentericus - картофельная палочка, Bac. megatherium - капустная палочка) по многим своим свойствам схожих с палочкой сибирской язвы. Существующие бактериологические методы не всегда позволяют легко выделить возбудителя сибирской язвы из почвы. Основная трудность состоит в отделении спор от частиц почвы. Из многих известных методов более надежным является метод предварительной подготовки пробы почвы по следующей методике: 1.100 г исследуемой почвы заливают 5-10 кратным объемом стерильного фосфатного буфера или воды; 2. Шуттелируют взвесь в течение 20-30 мин, с последующим 5-8 мин отстаиванием; 3. Фильтрование через 2-3 слоя марли; 4. Прогревание полученной суспензии в водяной бане в течение 30 мин при 70⁰С для уничтожения сопутствующей вегетативной микрофлоры; 5. Посев полученной суспензии в МПБ и на поверхность МПА в чашках Петри для получения изолированных колоний; 6.Заражение полученной культурой 5-10 белых мышей, подкожно в дозе 0,1-0,2 мл; 7. Вскрытие павших мышей и выделение чистой культуры возбудителя сибирской язвы.

Для выделения чистой культуры возбудителя сибирской язвы из исследуемого материала загрязненного посторонней микрофлорой, предложены селективные среды, в состав которых вводят 200-500 ЕД/мл полимиксина в сочетании с триметопримом, которые подавляют рост сопутствующей микрофлоры: мезофильных бактерий, B.subtilis, B.cereus и E.coli.

Задание для самостоятельной работы

1. Провести бактериологическое исследование различных образцов почвы методом серийных разведений для определения количества МАФАнМ посевом в чашки Петри. Чашки поставить в термостат.

2. На следующем занятии провести подсчет выросших колоний, определить количество МАФАнМ в 1 г исследуемой почвы.

3. Провести демонстрацию посева исследуемых образцов почвы в среды Кесслера для определения коли-титра.