Методы санитарно-микробиологических исследований

Современная санитарная микробиология при индикации и идентификации санитарно-показательных и патогенных микроорганизмов, при определении общей микробной обсемененности объектов окружающей среды стремится использовать все те методы, которые применяются в диагностических микробиологических лабораториях:

микроскопический – при индикации и прямом подсчете микроорганизмов в исследуемом объекте;

бактериологический – выделение микроорганизмов и их идентификация;

биологический – заражение чувствительных животных и ускоренные методы исследований (РИФ и др.).

Для получения разносторонней и полноценной санитарно-микробиологической характеристики объектов окружающей среды, как правило, используется комплекс тестов. К ним относится определение общей микробной обсемененности (общего микробного числа).

Общая микробная обсемененность объекта характеризуется количеством микроорганизмов в 1 мл воды, жидкости или в 1 г твердого вещества (продукта). Определение микробного числа является косвенным методом и позволяет судить о возможности загрязнения изучаемого объекта патогенными микроорганизмами.

Существует два метода определения микробной обсемененности:

- метод прямого подсчета под микроскопом;

- метод количественного посева различных разведений образцов и проб исследуемого объекта.

Первый метод – метод прямого подсчета микроорганизмов в исследуемом объекте проводится под микроскопом в счетных камерах Горяева или в камерах, специально сконструированных для подсчета бактерий. Предварительно пробу исследуемого объекта подвергают обработке, чтобы получить гомогенную взвесь. Для лучшего учета бактерий в исследуемую суспензию добавляют краситель.

Второй метод – метод количественного посева исследуемого материала на плотные питательные среды – применяется наиболее часто. Из приготовленных серийных десятикратных разведений исследуемой жидкости или суспензии по 1 мл переносят в стерильные чашки Петри (начиная с большего разведения, каждое разведение отдельной пипеткой) и заливают расплавленным и охлажденным до 45-50⁰С мясопептонным агаром.

Следует отметить, что оба метода определения общей микробной обсемененности, являются относительными и приблизительными. Для получения сравнимых результатов при определении общего микробного числа исследования проводятся по стандартным, конкретным для каждого случая методикам, регламентированным соответствующими ГОСТами.

Выявление в каждом конкретном случае порчи объекта окружающей среды ведется по схемам исследования, разработанным для каждой группы микроорганизмов.

Бактерии группы кишечных палочек (бгкп)

Впервые Escherihia coli (кишечную палочку) Т.Эшерих выделил в 1885 г из фекалий больного. Кишечная палочка является постоянным обитателем толстого отдела кишечника человека, млекопитающих, птиц и рыб. Среди бактерий E. сoli наряду с сапрофитными штаммами встречаются энтеропатогенные, способные вызвать желудочно-кишечные заболевания людей и животных.

Морфология. Это полиморфные палочки с закругленными концами длиной 1-3 мкм, грамотрицательные, не образующие спор, подвижные перитрихи (встречаются и неподвижные). Капсулу образуют лишь патогенные серовары (08, 09, 0101).

Культуральные свойства. Е. coli аэроб или факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 37-38⁰С, рН среды 7,0-7,4. Хорошо растет на обычных питательных средах – МПА, МПБ, средах Эндо и Левина. На МПА через 24 ч появляются сочные, круглые с ровными краями и гладкой поверхностью (s-форма) серо-белого цвета колонии. В МПБ образуют интенсивное помутнение среды и осадок на дне пробирки, легко разбивающийся при встряхивании.

Биохимические (ферментативные) свойства у бактерий E. сoli хорошо выражены, в отличие от других бактерий семейства Enterobacteriaciae они сбраживают лактозу до кислоты и газа, что используется для дифференциации и идентификации.

К бактериям группы кишечной палочки отнесены 3 рода бактерий: Escherihia, Citrobacter и Enterobacter. Два последних рода близки, в отличие от рода Escherihia они имеют ограниченное санитарное значение и не расцениваются как показатели свежего фекального загрязнения, так как их чаще обнаруживают в почве, на растениях.

Во всех ранее существовавших классификациях уделялось большое внимание способности кишечных палочек сбраживать лактозу, так как считалось, что средой обитания лактозоотрицательных палочек являются почва, вода, растения.

В связи с неодинаковым санитарно-показательным значением отдельных родов в настоящее время для дифференциации Escherihia coli фекального происхождения от других БГКП (Citrobacter и Enterobacter) предложен комплекс признаков обозначенных абревиатурой - ТИМАЦ.

Т – температурный тест (тест Эйкмана);

И – тест на индолообразование;

М – реакция с метиловым красным;

А - реакция на ацетиметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра);

Ц – цитратный тест.

Признаки, входящие в этот комплекс, определяют принадлежность БГКП к одному из трех родов: Escherihia, Citrobacter и Enterobacter.

Температурный тест. Для подтверждения фекального происхождения выделенных штаммов Escherihia coli, принимают ее способность сбраживать углеводы при температуре 43-44⁰С, превышающей температуру тела человека, т.е. температурный тест. Большинство бактерий родов Citrobacter и Enterobacter такой способностью не обладает.

Образование индола. Суть метода сводится к тому, что 98% выделенных штаммов Escherihia coli способны расщеплять аминокислоту триптофан, входящую в состав многих белков и пептонов питательной среды, с выделением ряда продуктов, в том числе и индола, окрашивающего питательную среду в красный цвет при взаимодействии с реактивами, содержащими параметиламидобензальдегид. Бактерии из родов Citrobacter и Enterobacter индол не образуют.

Реакция с метиловым красным (реакция Кларка). Эта реакция применяется для определения интенсивности кислотообразования при сбраживании глюкозы в питательной среде. В качестве индикатора используют метиловый красный, который изменяет окраску от светло-желтой до красной при рН 5,0 и ниже (при рН выше 5,0 среда остается светло-желтой). Считается, что типичные Escherihia coli сбраживают глюкозу до кислоты и газа более интенсивно, чем Enterobacter.

Образование ацетилметилкарбинола. С помощью этой реакции определяют способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ацетилметилкарбинол. Его образуют Enterobacter, а Escherihia coli и Citrobacter такой способностью не обладают.

Способность микроорганизмов образовывать в среде с глюкозой ацетилметилкарбинол определяют по следующей методике: к 5 мл культуры 4-5 суточного возраста, выращенной на пептонной воде с глюкозой или на среде Кларка, добавляют такой же объем 40%-ного раствора КОН. При наличии ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет.

Цитратный тест основан на способности некоторых микроорганизмов усваивать лимонную кислоту и ее соли в питательной среде.

Citrobacter и Enterobacter растут на цитратных средах и получили название цитратположительные бактерии, а Escherihia coli фекального происхождения не утилизируют цитрат и являются цитратотрицательными.

ГОСТом предусмотрено проведение цитратного теста при контроле молока и молочных продуктов на среде Козера.

Сбраживание лактозы. Во всех ранее существовавших классификациях уделялось большое внимание способности кишечной палочки сбраживать лактозу. Этот признак был дифференцирующим при определении санитарно-показательного значения изучаемых микроорганизмов. Считалось, что лактозоотрицательные варианты отличаются от лактозоположительных тем, что средой обитания их являются почва, вода, растения.

Однако в кишечнике человека и животных, а также во внешней среде можно обнаружить различные варианты кишечных палочек, которые имеют не типичные для рода Escherihia признаки. Это объясняется тем, что у кишечной палочки, под влиянием различных факторов внешней среды происходит изменение ряда биологических свойств: утрата способности сбраживать лактозу и ферментировать углеводы при 43⁰С и даже при 37⁰С.

Следовательно, этот признак нестабильный, поэтому в настоящее время при классификации или для подтверждения фекального происхождения выделенных штаммов кишечной палочки определяют способность не просто сбраживать лактозу, а способность сбраживать углеводы при температуре, превышающей температуру тела человека и животных, т.е. температурный тест.

В комплексе ТИМАЦ температурный и цитратный тесты являются основными, наиболее стабильными позволяющими дифференцировать БГКП фекального происхождения от бактерий группы кишечных палочек, обитающих во внешней среде.

Использование БГКП в качестве санитарно-показательных

микроорганизмов в пищевой санитарной микробиологии

БГКП считаются классическим индикатором фекального загрязнения объектов внешней среды. В зависимости от целей исследования учитывают всю группу кишечных палочек или отдельных ее представителей. БГКП с точки зрения их санитарно-гигиенического значения Г.П.Калина (1968) делит на 3 подгруппы.

К первой подгруппе можно отнести БГКП в широком смысле этого слова ( грамотрицательные палочки, растущие на универсальных средах), сбраживающие глюкозу и лактозу или только глюкозу с образование К и Г (кислота и газ) при 37⁰С, которые не имеют собственно санитарного значения.

Во вторую группу входят бактерии, имеющие санитарно-показательное значение и указывающие на неопределенное по времени фекальное загрязнение, они обладают свойствами, характерными для первой подгруппы, но сбраживают глюкозу и лактозу или глюкозу при 43-45⁰С.

В третью подгруппу включают бактерии, являющиеся показателями свежего и несомненно фекального загрязнения (E. сoli). К ним относятся микроорганизмы, обладающие свойствами, характерными для бактерий второй подгруппы, но не растущие на среде Козера с цитратными солями и сбраживающие углеводы при 43-45⁰С.

В настоящее время многие исследователи считают, что при оценке качества воды и пищевых продуктов санитарно-показательное значение имеют представители любой из подгрупп кишечной палочки, способные размножаться при 43⁰С и сбраживать глюкозу с образованием газа.

Энтеропатогенные кишечные палочки

В своей естественной среде обитания – содержимом толстого кишечника – кишечная палочка является комменсалом и, несомненно, играет положительную роль.

В то же время в литературе многократно были описаны вспышки пищевых токсикоинфекций, вызванных энтеропатогенными кишечными палочками. Исследования антигенного строения кишечной палочки показали, что возбудителями кишечных заболеваний являются определенные серологические типы E. сoli:

- у телят чаще выделяются серогруппы 08, 09, 015, 0101 и др;

- у поросят – 08, 09, 0137, 0138 и др;

- у человека 026, 055, 0111 и некоторые другие серогруппы, в основном обладающие соматическим О-антигеном. Эти типы относятся к энтеропатогенным.

Энтеропатогенные кишечные палочки вызывают заболевания: колибактериоз молодняка, мастит у коров, острые кишечные заболевания у детей. Энтеропатогенные типы кишечных палочек выделяются и от здоровых людей и животных. Имеются мнения, что основной причиной заболевания могут являться токсины, вырабатываемые кишечными палочками прижизненно и, следовательно, заболевания можно рассматривать скорее как интоксикацию, чем токсикоинфекцию.

Возможность возникновения заболевания у людей зависит от ряда факторов – дозы микроба, возраста заболевшего, состояния организма и др.

Обеззараживание условно годного мяса. Если есть дистрофические изменения в мышцах, то туши и внутренние органы подлежат утилизации. При отсутствии таких изменений, на утилизацию направляют только внутренние органы, а туши используют для приготовления продукции, в технологическом процессе которой предусматривается термическая обработка.