Методики определения резус-нринадлежности крови

Для определения резус-принадлежности крови необходимо иметь стандартные высокоактивные реактивы. В настоящее время применяют реактивы двух видов: приготовленные из сыворотки крови лиц, иммунизированных к антигенам системы Резус, и реактивы на основе моноклональных антител.

Для практического применения выпускают моноклональные антитела (получают с помощью биотехнологии гибридом) следующей специфичности: анти- D и анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е.

Цоликлон анти-D-Супер содержит полные (IgM) анти-D АТ.

Стандартные диагностические сыворотки для определения резус-принадлежности получают из крови резус-отрицательных лиц, сенсибилизированных резус-АГ в результате гемотрансфузии или при беременности.

Определение резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева с моноклональными антителами IgM анти-d

Оснащение:

- моноклональные антитела IgM анти-D;

- белая смачиваемая поверхность;

- раствор натрия хлорида 0,9%;

- стеклянная палочка.

Порядок проведения исследования:

1. На белой пластине со смачиваемой поверхностью написать Ф.И.О. исследуемого лица.

2. На левом краю пластины надписать серию реактива анти-D, используемого для исследования. Рядом сделать надпись: контроль.

3. Соответственно надписям поместить под ними по одной капле реактива IgM анти-D и одну каплю контрольного реактива (если контрольный реактив входит в комплект и поставляется производителем).

4. Во все капли добавить по маленькой капле исследуемых эритроцитов и перемешать стеклянной палочкой до образования капли диаметром 1,5 см. Палочку каждый раз вымыть и тщательно вытереть досуха. Перемешивание начинают с контроля.

5. Пластину покачивать в течение 5 минут, затем в каждую каплю добавить 5-6 капель раствора натрия хлорида 0,9% для снятия возможной неспецифической агглютинации. После чего пластину покачивать еще 5 минут.

Трактовка результатов:

Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации невооруженным глазом.

Наличие агглютинации в капле с реактивом анти-D свидетельствует о положительной реакции и указывает на резус-положительную принадлежность.

Отсутствие агглютинации с реактивом анти-D свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности.

Результат считается истинным при отсутствии агглютинации в капле с контрольным реактивом.

IgM анти-D (цоликон анти-D-супер)не взаимодействуют с некоторыми образцами D слабого и D вариантного антигенов, поэтому при исследовании резус-принадлежности крови доноров все отрицательные результаты необходимо исследовать с реактивами анти-D, содержащими IgG.

Проба Кумбса для определения неполных анти-резус антител

При постановке непрямой пробы Кумбса материалом для исследования служит сыворотка пациента, в которой следует определить присутствие неполных антител.

Непрямая проба Кумбса состоит из двух этапов, первый из которых заключатся в создании условий для фиксации неполных антител предположительно присутствующих в испытуемой сыворотке, на поверхности стандартных эритроцитов с известной антигенной специфичностью. Второй этап реакции - выявление фиксированных антител на поверхности стандартных эритроцитов с помощью антиглобулиновой сыворотки.

- При проведении реакции в штатив устанавливают пробирки по числу образцов эритроцитов, с которыми проводится испытание сыворотки и во все пробирки вносят по 0,15 мл (3 капли) испытуемой сыворотки.

- Затем вносят по 0,01 мл (очень маленькая капля из тонкой пастеровской пипетки) из отмытых стандартных эритроцитов со дна пробирки в соответствии с обозначениями и нумерацией пробирок.

- Содержимое пробирок тщательно перемешивают и инкубируют при 37⁰С

30 минут, что необходимо для фиксации неполных антител на поверхности стандартных эритроцитов.

- После извлечения пробирок из термостата в них добавляют до верха изотонический раствор NaCl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют и проводят такое отмывание трижды.

- Затем к отмытым эритроцитам в каждую пробирку добавляют 4-7 капель физиологического раствора для получения 5% взвеси

- Каплю взвеси (0,05 мл) эритроцитов из каждой пробирки переносят на плоскость белого цвета со смачиваемой поверхностью и добавляют к ним по капле (0,05 мл) антиглобулиновой сыворотки (АГС).

- Эритроциты и АГС перемешивают стеклянной палочкой учитывают реакцию, наблюдая за нею при покачивании пластины

Агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд однако наблюдение продолжают до 20 минут, т.к. при низких титрах анти - резус антител реакция может наступать замедленно.

Интерпретация результатов

При наличии агглютинации исследуемой сыворотки с образцами стандартных резус-положительных эритроцитов и отсутствии реакции с резус-отрицательными образцами и собственными эритроцитами можно делать вывод о наличии в сыворотке обследуемого неполных резус - антител.

Отсутствие агглютинации со всеми образцами стандартных и аутоэритроцитов свидетельствует об отсутствии анти - резус неполных антител.