Литература

• Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. – «Мир»:М., 1980

Занятие № 13

ТЕМА: Итоговое занятие: Физические методы исследования биомакромолекул

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Поглощение света. Закон Бугера-Ламберта-Бэра. Молярный коэффициент поглощения.

2. Спектры поглощения биомолекул в видимой и ультрафиолетовой области спектра. Спектры поглощения аминокислот и нуклеотидов.

3. Гипохромный и гиперхромный эффекты в спектрах поглощения белков и нуклеиновых кислот.

4. Отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера. Влияние мутности раствора.

5. Способы регистрации молекулярных спектров поглощения. Устройство одно- и двулучевых спектрофотометров.

6. Энергия возбужденного состояния. Пути растраты энергии. Синглетное и триплетное состояние. Интеркомбинационная конверсия. Время жизни возбужденного состояния. Времена жизни синглетных и триплетных состояний.

7. Квантовый выход флуоресценции. Факторы, определяющие интенсивность флуоресценции. Внутреннее и внешнее экранирование.

8. Температурная зависимость квантового выхода флуоресценции. Эффект Шпольского.

9. Спектры возбуждения и испускания флуоресценции. Стоксов сдвиг при флуоресценции и фосфоресценции.

10. Тушение флуоресценции. Уравнение Штерна-Фольмера.

11. Флуоресценция субстратов и коферментов.

12. Собственная флуоресценция аминокислот. Зависимость характеристик спектров испускания от окружения.

13. Собственная флуоресценция белков. Зависимость характеристик флуоресценции от состояния белка.

14. Флуоресцентные зонды и метки. Основные принципы их использования при изучении свойств биомакромолекул.

15. Поляризация флуоресценции. Формула Яблонского-Перрена.

16. Способы регистрации спектров флуоресценции. Функциональная схема спектрофлуориметра.

17. Перенос электрона в двухуровневой системе. Обратимость процесса. Условия обеспечения необратимости процесса переноса электрона.

18. Туннелирование электронов и ядер. Электронно-колебательные взаимодействия при туннелировании электрона.

19. Индуктивно-резонансный перенос энергии электронного возбуждения. Механизм Фёрстера. Расстояния переноса. «Флуоресцентная линейка».

20. Обменно-резонансный перенос энергии. Возможность переноса в системах триплет-триплет, синглет-синглет, синглет-триплет. Расстояния переноса.

21. Экситонный механизм миграции энергии.

22. Перенос электрона в процессе фотосинтеза.

23. Принцип метода ЭПР. Механический и магнитный моменты электрона. Магнетон Бора.

24. Эффект Зеемана. Основное уравнение резонанса. G-фактор.

25. Характеристики спектров ЭПР: амплитуда, форма линии, ширина линии.

26. Времена продольной и поперечной релаксации (T₁, T₂).

27. Расщепление линий. Сверхтонкая структура спектров ЭПР.

28. Устройство радиоспектрометра ЭПР.

29. Применение ЭПР в медико-биологических исследованиях. Метод спиновых меток и зондов. Метод спиновых ловушек.

30. Спины ядер. Ядра с получисленным спином. Ларморова прецессия. Основное уравнение резонанса.

31. ЯМР: химический сдвиг, расщепление линий.

32. ЯМР: спин-спиновая и спин-решеточная релаксация.

33. Использование ЯМР в исследовании структуры и функции биомакромолекул.

Задачи

Абсорбционная спектроскопия.

1. Поглощение раствора, содержащего вещество с молекулярным весом 423 в концентрации 32 мкг/мл, составляет 0,27 при 540 нм в односантиметровой кювете. Чему равен коэффициент молярного погашения при 540 нм? Допустить, что закон Бера соблюдается.

2. Раствор соединения А имеет D260=0,45 и D450=0,03. Раствор второго соединения Б имеет D260=0,004 и D450=0,81. 2 мл раствора А смешали с 1 мл раствора Б. Результирующая оптическая плотность смеси D260=0,3 и D450=0,46. Имеется ли взаимодействие между А и Б? Объяснить. Какое допущение делается, чтобы подтвердить это заключение?

3. Раствор соединения А имеет D260=0,45 и D450=0,03. Раствор второго соединения Б имеет D260=0,004 и D450=0,81. 2 мл раствора А смешали с 1 мл раствора Б. Результирующая оптическая плотность смеси D260=0,3 и D450=0,28. Имеется ли взаимодействие между А и Б? Объяснить. Какое допущение делается, чтобы подтвердить это заключение?

4. Предположим, что вы захотели узнать, сколько цитохрома с содержится в одной клетке Е. coli. Известен молярный коэффициент погашения в максимуме поглощения. Как вы проделаете это измерение?

5. Молярный коэффициент погашения данного соединения 348 при 482 нм. Раствор этого соединения имеет D482=1,6. При разбавлении 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 и 1:6 величины D482 составляют 1,52, 1,42, 1,05, 0,84, 0,70 и 0,61 соответственно. Какова молярность исходного раствора?

6. Молярные коэффициенты погашения вещества А при 260 и 280 нм равны соответственно 5248 и 3150. Для выделения А используется реагент Б, имеющий молярные коэффициенты погашения 311 и 350 при 260 и 280 нм. После выделения А D260=2,50 и D280=2,00. Какова концентрация А?

7. Белок помещают в 20%-ный раствор этиленгликоля и снимают его дифференциальный спектр против раствора, не содержащего этиленгликоля. При всех длинах волн =0. Что вы можете заключить о структуре белка?

8. Белок изучают в 20%-ном диметилсульфоксиде и 20%-ной сахарозе. В сахарозе =0. В диметилсульфоксиде проявляется характерный дифференциальный спектр триптофана. Наблюдаемая величина  удваивается, если белок нагревают в диметилсульфоксиде до 60°С. В 20%-ной сахарозе после нагревания до 60°С величина .эквивалентна  для 8 триптофановых остатков. Что вы можете сказать об этом белке?

9. В процессе титрования белка при 295 нм найдено, что 295 резко возрастает при рН 9,6. При рН 11,7 295 возрастает снова, причем это увеличение составляет одну треть от первого. Если затем рН понизить до 6 и далее постепенно увеличивать, кривая зависимости 295 от рН почти идентична кривой белка до титрования, за исключением того, что увеличение 295 составляет только две трети от наблюдаемого вначале. Известно, что в белке имеется восемь тирозиновых остатков. Что вы можете сказать о структуре белка?

Флуоресцентный анализ.

1. Белок вызывает флуоресценцию АНС. Если концентрацию белка увеличить до прибавления АНС, флуоресценция понижается. Дать два возможных объяснения понижению флуоресценции.

2. Для определения доступности триптофановых остатков растворителю можно использовать тушение триптофановой флуоресценции иодид-ионами. Известно, что белок содержит только один триптофан, флуоресценция которого не тушится иодид-ионами. Каковы возможные объяснения отсут­ствия тушения?

3. Для определения доступности триптофановых остатков растворителю можно использовать тушение триптофановой флуоресценции иодид-ионами. Известно, что белок содержит восемь триптофановых остатков и иодид-ионы тушат 25% флуоресценции. Напрашивается предположение, что два триптофановых остатка доступны растворителю. Укажите несколько фактов, которые могли бы сделать это заключение необоснованным.

4. Когда образуются эксимеры, их спектр возбуждения совпадает со спектром мономера, потому что мономер возбуждается до димеризации. Если присутствует много димеров и димер возбуждается, можно ли ожидать, что спектр возбуждения будет соответствовать спектру поглощения мономера? Поясните.

5. Интенсивность флуоресценции понижается вследствие тушения иодид-ионом. Можно ли ожидать также изменения формы спектров возбуждения и испускания?

6. Дайте описание нескольких возможных механизмов возрастания квантового выхода флуоресцирующего хромофора при связывании с ним другой молекулы. Почему иногда могут быть сдвиги спектров возбуждения (или испускания) или обоих вместе? Происходит ли сдвиг в сторону длин­ных или коротких длин волн?

7. Всегда ли спектр возбуждения флуоресцирующего хромофора такой же, как спектр поглощения? Поясните.

8. Белок, содержащий десять триптофановых остатков, имеет сильную триптофановую флуоресценцию. Маленькая молекула, способная прочно свя­зываться с белком, фактически не изменяет его флуоресценции, хотя изве­стно, что в участке связывания имеется два триптофановых остатка. Дайте несколько возможных объяснений этому.

9. Когда флуоресцирующий хромофор акридиновый оранжевый связывается с ДНК и смесь облучается светом, который поглощается акридиновым оранжевым, в ДНК происходят необратимые химические изменения (например, разрушаются пуриновые кольца, рвутся одноцепочечные спиральные структуры). Чтобы происходили эти изменения, необходимо присутствие молекулярного О2; поэтому этот процесс называется фотосенсибилизирован-ным окислением или фотоокислением. Такие реакции происходят со многими акридиновыми производными; эффективность реакции приблизительно пропор­циональна квантовому выходу флуоресценции. Предложите механизм фотоокисления.

10. Флуоресцирующий хромофор ковалентно присоединен к белку. Измерена поляризация флуоресценции в зависимости от ионной силы буфера, в котором суспендирован белок; найдено, что она заметно уменьшается по мере возрастания ионной силы. Как влияет на белок возрастание ионной силы?

11. В белке имеется флуоресцирующий хромофор F, ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните следующее наблюдение. Иодид-ион тушит флуоресценцию F, а не триптофана.

12. В белке имеется флуоресцирующий хромофор F, ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните следующее наблюдение. Иодид-ион тушит флуоресценцию F и триптофана.

13. В белке имеется флуоресцирующий хромофор F, ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните следующее наблюдение. Доведение рН до 9 приводит к исчезновению флуоресценции F и увеличению флуоресценции триптофана (допустим, что отсутствует влияние рН на свободный триптофан или несвязанный F).

14. В белке имеется флуоресцирующий хромофор F, ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните следующее наблюдение. Доведение рН до 9 приводит к исчезновению флуоресценции триптофана и заметному увеличению флуоресценции F.