Литература

• Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическими системам. М.: «Мир», 1980

Занятие № 3 (лабораторная работа)

ТЕМА: Равновесное связывание лигандов с биомакромолекулами

Цель: Приобрести практические навыки определения физико-химических характеристик взаимодействия

Вопросы для рассмотрения на занятии:

1. Закон Бугера-Ламберта-Бера, отклонения. Физический смысл молярного коэффициента погашения (экстинции). Оптическая плотность.

2. Характер зависимости концентрации комплекса «белок-лиганд» от концентрации лиганда.

3. Способы линеаризации зависимости «Концентрация лиганда - Эффект». Координаты Лайнуивера-Берка, Скетчарда, Эди-Хофсти.

4. Определение параметров уравнения линейной регрессии с использованием утилит программы MS Excell.

5. Выполнение практической работы по определению параметров связывания бромкрезолового зеленого с альбумином на спектрофотометре СФ-46

Практическая работа:

Реактивы и оборудование: Спектрофотометр СФ-46, буферные растворы рН = 4.4 и рН = 7.4, альбумин 5 мг/мл (на физ.растворе) , бромкрезоловый зеленый 8 мг/мл (на буфере).

1. Приготовить необходимое количество (см. задание по группам) раствора БКЗ с концентрацией 0,1 ммоль/л из маточного (8 мг/мл)

2. Приготовить растворы БКЗ заданной молярной концентрации (С1-С6, от 0,01 до 0,1 мкм/л).

3. Приготовить серию контрольных и опытных проб. В опытной пробе к 2 мл точного раствора БКЗ добавляется 100 мкл раствора альбумина. В контрольной пробе, вместо раствора альбумина берется дистиллированная вода.

4. Измерить оптическую плотность растворов при 625 нм. Оптическая плотность опытной пробы меряется относительно соответствующего контроля.

5. Построить график зависимости D от D/[L].

6. Рассчитать константы связывания.

7. Применить функции программы Exell в расчетах характеристик связывания и оценки аналитических ошибок. Добавить на график линию тренда и уравнение прямой с достоверностью уровня аппроксимации.

D

D/[L]

Задание по группам

	БКЗ 0,1 ммоль/л	Буфер рН 4,4		№	Контроль 100 мкл H2O	Опыт 100 мкл альбумина
C1	1 мл	9 мл		1	По 2мл С1	По 2мл С1
C2	1 мл	4 мл		2	По 2мл С2	По 2мл С2
C3	2 мл	3 мл		3	По 2мл С3	По 2мл С3
C4	3 мл	2 мл		4	По 2мл С4	По 2мл С4
C5	4 мл	1 мл		5	По 2мл С5	По 2мл С5
C6	5 мл	0 мл		6	По 2мл С6	По 2мл С6

Mr (БКЗ) = _______

К_св = ______

Самостоятельная работа

1. Чем спектрофотометр отличается от фотоэлектроколориметра?

2. Какие кюветы необходимо использовать при работе на длинах волн УФ-диапазона?

3. Дайте определение понятию «хромофор».

4. Спектр поглощения.