Тема 2 бактериологические красители. Приготовление бактериальных препаратов для световой микроскопии. Простые методы окраски бактерий

Цель занятия. Ознакомить студентов с основными бактерио­логическими красителями, техникой их приготовления и мето­дом простой окраски бактериальных препаратов.

Оборудование и материалы. Набор сухих бактериологических красок и их растворов, культуры бактерий на МПА и в МПБ (Е. coli, S. aureus), световые микроскопы, обезжиренные пред­метные стекла, фуксин Пфейффера, красящие бумажки по Си­неву, раствор метиленового синего, фильтровальная бумага для высушивания мазков, физиологический раствор.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Обычно форму, взаимное расположение, некоторые особенно­сти химического состава и строения бактериальных клеток опре­деляют путем микроскопии окрашенных препаратов. Оптическая плотность неокрашенных бактерий близка к оптической плотнос­ти стекла, поэтому бактерии плохо различимы при микроскопиро-вании. Окрашенные клетки, наоборот, четко видны. Кроме того, болезнетворные микроорганизмы в процессе обработки инактивируются, что делает препарат безопасным для исследователя.

Отношение к различным красителям и методам окраски на­зывают тинкториальными свойствами микроорганизмов.

Бактериологические красители. Для окрашивания бактериаль­ных клеток применяют синтетические анилиновые красители, которые дифференцируют на основные и кислые. У основных красителей ионом, придающим бактериальной клетке окраску, служит катион, у кислых — анион. Структуры бактерий, взаимо­действующие с красителем, преимущественно отрицательно за­ряжены и поэтому лучше воспринимают основные красители.

Основные красители. Красные (нейтральный красный, пиро-нин, сафранин, основной фуксин); фиолетовые (генциан фиоле­товый, кристаллический фиолетовый, гематоксилин, тионин); синие (виктория, метиленовый синий); зеленые (малахитовый зеленый, метиленовый зеленый, янус зеленый); коричневые (везувин, хризоидин); черные (индулин).

Кислые красители. Розовые и красные (кислый фуксин, эозин, эритрозин, гропеолин); желтые (аурантил, конго, пикриновая кислота); черные (нигрозин).

Спиртовые растворы. Эти растворы длительного хранения го­товят из сухих порошковых красок. Растворы сначала выдержи­вают в термостате для лучшего растворения веществ, затем филь­труют через бумажные фильтры, чтобы избавиться от нераство­рившихся микрочастиц, которые при окраске препаратов оседа­ют на клетках, тем самым затрудняя их изучение под микроско­пом.

Далее приведены рецепты спиртовых растворов красок, наи­более часто применяемых в микробиологии.

Карболовый фуксин Циля: раствор А: основной фуксин —0,3 г, 96%-й этанол —10 мл; раствор Б: фенол — 5 г, вода дистиллированная — 95 мл. Растворы А и Б смешивают.

Фуксин Пфейффера — это фуксин Циля, разведен­ный водой в соотношении 1 : 10 (из-за нестойкости используют только в течение рабочего дня).

Карболовый кристаллический фиолето­вый: раствор А: кристаллический фиолетовый — 0,4 г, 96%-й этанол — 10 мл; раствор Б: фенол — 1 г, вода дистиллирован­ная — 100 мл. Растворы А и Б смешивают.

Щелочной метиленовый синий Леффлер а: раствор А: метиленовый синий — 0,3 г, 96%-й этанол — 30 мл; раствор Б: 0,01%-й раствор гидроксида калия — 100 мл. Ра­створы А и Б смешивают.

Водные растворы. Так как эти растворы красителей нестойкие, их готовят непосредственно перед использованием (ex tempore).

Раствор сафранина: сафранин — 2 г, вода дистилли­рованная горячая (/= 90 °С) — 100 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор малахитового (бриллиантового) зеленого: малахитовый зеленый — 1 г, вода дистиллирован­ная горячая —100 мл. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор Люголя — стойкий раствор используют для окраски по методу Грама: йод кристаллический — 1 г, йодид ка­лия—2 г, вода дистиллированная — 10 мл. Смесь выдерживают 24 ч при 37 °С, после чего добавляют дистиллированную воду до 300 мл и одну-две капли глицерина.

Приготовление бактериальных препаратов для световой микроско­пии. Приготовление окрашенных бактериальных препаратов вклю­чает в себя приготовление мазка, его высушивание, фиксацию и окрашивание. Материалом для исследования служат культуры бак­терий на плотных или жидких питательных средах или нативный материал: органы, ткани, воспалительный экссудат и т. д. Препара­ты готовят на чистых, обезжиренных предметных стеклах.

На предметное стекло наносят исследуемый материал. Если материал жидкий и находится в бактериологической пробирке (бульонная культура), то пробирку берут в левую руку, в пра­вую — бактериологическую петлю (как пишущее перо), прожига­ют ее в пламени горелки, мизинцем правой руки захватывают пробку и над пламенем горелки извлекают ее из пробирки, края пробирки обжигают. Петлей, не смачивая петледержатель, берут материал и распределяют на предметном стекле по площади раз­мером 2 см². Края пробирки вновь обжигают, закрывают ее проб­кой, обжигают бактериологическую петлю.

Аналогичным образом готовят мазок из агаровой культуры, осторожно захватывая петлей бактериальную массу с поверхнос­ти питательной среды. На предметное стекло в этом случае пред­варительно наносят каплю стерильного физиологического ра­створа, в котором петлей суспендируют бактериальную массу.

Из животных тканей готовят мазки-отпечатки: стерильно вы­резают кусочек органа, поверхностью среза несколько раз каса­ются поверхности предметного стекла.

Приготовленный мазок высушивают на воздухе.

Мазок фиксируют для прикрепления бактериальных клеток к поверхности стекла и их инактивации. Применяют физичес­кий и химический способы фиксации. При физическом способе препарат обратной стороной стекла два-три раза мед­ленно проводят над пламенем горелки. Чрезмерное нагревание вызывает изменение формы клетки и ее тинкториальных свойств. При химическом способе на предметное стекло с маз­ком наносят одну из следующих жидкостей: 96%-й этанол — на 10 мин; ацетон — на 5 мин; смесь этанола и эфира (соотношение 1 : 1) — на 10...15 мин.

Фиксированный препарат окрашивают одним из методов.

Раствор краски смывают дистиллированной водой, препарат подсушивают фильтровальной бумагой или на воздухе и микроскопируют.

Процедуру окрашивания препарата проводят на «мостике» (параллельные стеклянные трубки) над сливной чашкой.

Простые методы окраски бактерий. При этом способе окраши­вания используют один краситель: например, на мазок наносят фуксин Пфейффера на 2...3 мин или метиленовый синий Леффлера на 3...10 мин. В таком препарате можно определять форму клеток, их взаимное расположение.