Задание для самостоятельной работы

Приготовить препараты бактерий из бульонных и агаровых культур, окрасить одним из красителей простым методом.

Контрольные вопросы

1. Какие бактериологические красители наиболее часто применяют в лабораторной практике?

2. Как их готовят?

Тема 3 сложные методы окраски бактерий: окраска по методам грама и циля-нильсена

Цель занятия. Ознакомить студентов со сложными методами окраски, с помощью которых дифференцируют грациликутные, фирмикутные и кислотоустойчивые бактерии.

Оборудование и материалы. Смесь культур Е. соli и S. aureus, смесь Е. coli, S. aureus и микобактерий (вакцина БЦЖ), красители для окраски бактерий по методам Грама и Циля-Нильсена, све­товые микроскопы, бактериологические петли, 96%-й этанол, фильтровальная бумага, предметные обезжиренные стекла, 5%-й раствор серной кислоты, дистиллированная вода.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

При сложных методах окраски используют несколько различ­ных красителей, что позволяет выявить особенности строения и химического состава клетки.

Окраска бактерий по методу Грама. Это один из наиболее рас­пространенных сложных методов окраски, основан на различиях в строении и химическом составе клеточной стенки. В зависимо­сти от результатов окрашивания все бактерии подразделяют на грамположительные и грамотрицательные.

При окрашивании генциановый фиолетовый в присутствии йода образует комплекс с компонентами клеточной стенки. У грамположительных прокариот клеточная стенка при обработке этанолом удерживает образовавшийся комплекс и бактерии ок­рашены в фиолетовый цвет; у грамотрицательных этанол вымы­вает этот комплекс и после дополнительного окрашивания пре­парата фуксином клетки приобретают красный цвет.

Этапы окраски. На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную спиртовым раствором генциан кристалл- или метилвиолета (бумажки по Синеву), на­носят на нее несколько капель дистиллированной воды для ув­лажнения, выдерживают 1...2мин, бумажку удаляют. Препарат, не промывая, обрабатывают раствором Люголя 1...2мин; раствор сливают. Затем наносят 96%-й этанол на 30...45 с, после чего препарат тщательно промывают водой и окрашивают фуксином Пфейффера 1...2мин. Вновь промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют.

Микроскопическая картина: бактерии, окрашенные в темно-фиолетовый цвет, относят к грамположительным, или фирмикутам, в красный цвет — к грамотрицательным, или грациликутам.

Основная сложность окраски по методу Грама — опасность переобесцвечивания препарата этанолом.

Чтобы избежать пере­обесцвечивания, разработан ряд модификаций, например моди­фикация Хукера.

Модификация Хукера. Готовят следующие красители: раствор А- кристаллвиолет — 2 г, 96%-й этанол — 20 мл; раствор Б: окса-лат аммония — 0,8 г; дистиллированная вода — 80 мл. Растворы А и Б смешивают в темном флаконе и оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Раствор В: 2,5%-й раствор сафранина (в 96%-м этаноле) — 10 мл, дистиллированная вода — 100 мл.

Фиксированный нагреванием мазок погружают в смесь ра­створов А и Б на 1 мин, после чего препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя 1 мин, затем вновь промывают водой и подсушивают. Наносят 96%-й этанол на 30 с, препарат тщательно промывают водой, подсушивают фильтровальной бу­магой и окрашивают раствором В 10 с, промывают водой, подсу­шивают и микроскопируют.

Окраска бактерий по методу Циля-Нильсена. Кислотоустой­чивые бактерии — грамположительные, однако повышенное со­держание в клеточной стенке липидов и миколовой кислоты придает клетке гидрофобные свойства, затрудняющие проник­новение в нее красителя и усиливающие ее устойчивость к воз­действию растворов кислот. Исходя из этих особенностей был разработан метод, с помощью которого выявляют кислотоус­тойчивые виды.

Фиксированный мазок окрашивают через фильтровальную бумажку (1 см²) карболовым фуксином Циля с подогреванием до появления паров; оставляют на «мостике» до остывания, повто­ряют нагрев. Общая экспозиция З...7мин. Бумажку удаляют, краску сливают, на препарат, не промывая водой, наносят 3...5%-й раствор серной кислоты на 5...7 с. Затем препарат про­мывают водой и окрашивают раствором метиленовой сини Леф-флера 4...5 мин, после чего промывают водой и подсушивают фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: кислота не обесцветила кислото­устойчивые бактерии, и они окрашены в красный цвет; некисло­тоустойчивые бактерии восприняли дополнительный синий кра­ситель.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

Из культур Е. coli и S. aureus приготовить мазки, окрасить по методу Грама, промикроскопировать и зарисовать.

Приготовить из смеси микобактерий (БЦЖ), Е. coli, S. aureus мазки, окрасить по методу Циля-Нильсена, промикро­скопировать и зарисовать.

Контрольные вопросы

1. Чем обусловлены тинкториальные особенности грамположительных и грамотрицательных бактерий?

2. На каких особенностях кислотоустойчивых бактерий основан метод окраски по Цилю-Нильсену.