- •Раздел I общая микробиология: морфология, физиология и генетика микроорганизмов
- •Тема 1 ветеринарно-бактериологическая лаборатория. Техника микроскопирования. Основные формы бактерий. Определение размеров микроорганизмов
- •Тема 2 бактериологические красители. Приготовление бактериальных препаратов для световой микроскопии. Простые методы окраски бактерий
- •Задание для самостоятельной работы
- •Контрольные вопросы
- •Тема 3 сложные методы окраски бактерий: окраска по методам грама и циля-нильсена
- •Тема 4 окраска бактерий с целью выявления спор, капсул, цитоплазматических включений. Методы обнаружения жгутиков. Метод прямого флуорохромирования бактерий
- •Тема 5 микроскопические грибы
- •Тема 6 стерилизация
- •Тема 7 питательные среды и культивирование микроорганизмов
- •Тема 8 техника посева, методы выделения чистых культур и культуральные свойства микроорганизмов. Определение количества бактерий
- •Контрольные вопросы
- •Тема 9 ферментативные (биохимические) свойства и принципы идентификации микроорганизмов
- •Тема 10 бактериофаги
- •Тема 11 антибиотики. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
- •Методические указания
- •Тема 12 генетика и генетические методы идентификации микроорганизмов
- •Раздел II инфекция и методы прикладной иммунологии
- •Тема 13 экспериментальное заражение лабораторных животных. Определение вирулентности и факторов патогенности микроорганизмов
- •Тема 14 методы определения факторов неспецифической резистентности и оценки иммунного статуса макроорганизма
- •Тема 15 серологические реакции: агглютинации (ра), непрямой гемагглютинации (рига), кумбса (рк). Оборудование для постановки серологических реакций
- •Тема 16 реакции преципитации (рп): кольцепреципитации (ркп), диффузионной преципитации (рдп); иммуноэлектрофорез
- •Тема 17 реакция связывания комплемента (рск)
- •Тема 18 метод флуоресцирующих антител (мфа). Иммуноферментный анализ (ифа)
- •Тема 19 реакция нейтрализации (рн)
- •Тема 20 средства специфической профилактики, терапии и диагностики инфекционных болезней
- •Тема 21 отбор, консервирование, транспортировка и хранение материала для микробиологического исследования. Принципиальная схема микробиологической диагностики инфекционных болезней
- •Раздел III частная микробиология
- •Тема 22
- •Лабораторная диагностика стафилококкозов и стрептококкозов. Биопрепараты
- •Тема 23 лабораторная диагностика рожи свиней и листериоза. Биопрепараты
- •Тема 24 лабораторная диагностика туберкулеза, паратуберкулеза, актиномикоза. Биопрепараты
- •Тема 25 лабораторная диагностика сибирской язвы. Биопрепараты
- •Тема 26 лабораторная диагностика злокачественного отека, анаэробной дизентерии ягнят, брадзота, инфекционной энтеротоксемии, эмфизематозного карбункула. Биопрепараты
- •Тема 27 лабораторная диагностика столбняка, ботулизма. Биопрепараты
- •Тема 28 лабораторная диагностика некробактериоза и копытной гнили. Биопрепараты
- •Тема 29
- •Тема 30 лабораторная диагностика сальмонеллеза. Биопрепараты
- •Тема 31 лабораторная диагностика чумы верблюдов и человека, псевдотуберкулеза. Биопрепараты
- •Тема 32 лабораторная диагностика бруцеллеза, туляремии.
- •Тема 33 лабораторная диагностика пастереллеза, гемофилезного полисерозита и актинобациллезной пневмонии свиней. Биопрепараты
- •Тема 34 лабораторная диагностика сапа, мелиоидоза и псевдомоноза норок. Биопрепараты
- •Тема 35 лабораторная диагностика лептоспироза, кампилобактериоза и дизентерии свиней. Биопрепараты
- •Тема 36 лабораторная диагностика микоплазмозов, риккетсиозов и хламидиозов. Биопрепараты
- •Тема 37 лабораторная диагностика дерматомикозов, микозов, вызываемых плесневыми и дрожжеподобными грибами. Биопрепараты
- •Тема 38 лабораторная диагностика микотоксикозов, вызываемых грибами родов aspergillus, penicillium, fusarium, stachybotrys, dendrodochium
- •Тема 39 санитарно-микробиологическое исследование воды, воздуха и почвы
Тема 29
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЭШЕРИХИОЗОВ (КОЛИ-ИНФЕКЦИИ). БИОПРЕПАРАТЫ
Цель занятия. Ознакомить студентов с методами лабораторной диагностики и биологическими свойствами возбудителей эшерихиозов.
Оборудование и материалы. Культуры Е. coli на МПА, средах Эндо, Левина, Симмонса, пластины ПБДЭ с результатами тестирования ферментативной активности Е. coli, пробирки цветного ряда с культурой Е. coli (лактоза, глюкоза, индол, среда с мочевиной), наборы агглютинирующих антиадгезивных и О-коли-сывороток, биопрепараты.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Эшерихиоз (колибактериоз). Острая инфекционная болезнь. Проявляется профузным поносом, признаками тяжелой интоксикации и обезвоживанием организма. Болеет молодняк сельскохозяйственных животных многих видов, включая птиц. Эшерихиоз может протекать в энтеритной, септической и энтеротоксемической формах.
Возбудители колибактериоза (эшерихиоза) — патогенные варианты бактерии. Е. coli, род Escherichia, семейство Enterobacteriaceae.
При энтеритной форме болезни возбудитель локализуется, в кишечнике и регионарных брыжеечных лимфоузлах; при септической форме — в крови, внутренних органах и тканях; при энте-ротоксемической — в тонком отделе кишечника и брыжеечных лимфоузлах. Считают, что ведущая роль в развитии эшерихиоза принадлежит кишечным палочкам, адгезивные антигены которых (К 88, К 99, F 41, 987 Р, А 20 и др.) обеспечивают прикрепление бактерий к эпителиальным клеткам тонкого отдела кишечника с последующим их размножением в клетках, продуцированием энтеротоксинов и проникновением сначала в регионарные лимфоузлы, а затем в кровь.
Эшерихии в своем составе содержат 164 варианта О-антигена, 55 вариантов Н-антигена и 90 вариантов К-антигена.
О-Антиген (соматический) термостабильный, состоит из полисахаридно-липидно-протеинового комплекса, который определяет серогрупповую принадлежность бактерий (известно свыше 160 серологических групп эшерихий).
К-Антиген (поверхностный) подразделяют на три вида, которые обозначают латинскими буквами L, В и A. L- и В-антигены термолабильные, разрушаются при 100 ºС в течение 1 ч. А-антиген (капсуальный) термостабильный, разрушается при автоклавирова-нии (121 °С) в течение двух часов, обнаружен у бактерий некоторых серологических групп (08, 09, 0101 и др.). Поверхностные (L, В, А) антигены препятствуют агглютинации бактерий соответствующей агглютинирующей О-сывороткой, поэтому при серогрупповой типизации культур эшерихий их подвергают термической обработке: прогреванию в водяной бане или автоклавированию.
Н-Антиген (жгутиковый) термолабильный, белковой природы, обнаружен у подвижных штаммов эшерихий. Сочетание О-, К- и Н-антигенов характеризует серологический вариант (серовар) бактерий.
Эпизоотические вспышки колибактериоза наиболее часто вызывают патогенные штаммы эшерихий следующих серогрупп: у телят - 08, 09, 015, 020, 026, 035, 078, 086, 0101, 0115, 0117, 0119, 0141, реже 02, 033, 041, 055, 0103, 0127, 0137; у поросят - 06, 026, 033, 0101, 0136, 0139, 0141, 0142, 0149, 0152, 0157; у ягнят - 04, 08,09, 015, 020, 028, 035, 041, 078, 0101, 0137; у птиц -01, 02, 08, 015, 018, 026, 055, 078, 0111, 0113, 0128, 0141.
У поросят-отъемышей энтеротоксемическая форма колибактериоза называется отечной болезнью.
Клинические признаки колибактериоза: слабость, потеря аппетита, угнетенное состояние животных, обезвоживание организма вследствие диареи. При затяжном течении наблюдают также серозно-гнойные выделения из носовых отверстий, артриты.
Отечная болезнь у поросят-отъемышей характеризуется появлением отеков век, носовой части головы, подчелюстной области. Нарушается координация движений, отмечают судороги, парезы, гиперемию кожи ушей, пятачка, живота. Иногда наблюдают кратковременное повышение температуры тела в начале болезни.
Лабораторная диагностика эшерихиоза основана на результатах бактериологического исследования.
Бактериологическое исследование включает в себя обнаружение возбудителя в исходном материале методом световой микроскопии, выделение чистой культуры, идентификацию возбудителя на уровне вида и определение его принадлежности к группе патогенных вариантов.
Материал для исследования. Для прижизненной бактериологической диагностики колибактериоза в лабораторию направляют фекалии больных животных (не менее чем от 5 животных с одной фермы), не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами. Пробы фекалий массой 1 ...2 г от каждого животного берут из прямой кишки в стерильные пробирки с помощью прокипяченного резинового катетера.
Микроскопия мазков из исходного материала. Мазки-отпечатки окрашивают по Граму. Е. coli — палочковидная грамотрицательная бактерия размером (0,3... 1) х (1...6) мкм со жгутиками (за редким исключением), спор и капсул не образует. Микробные клетки располагаются одиночно, парно или в виде коротких цепочек.
Выделение и идентификация культуры возбудителя. Е. coli — факультативный анаэроб, температурный оптимум 37...38 ºС, рН 7,2...7,4, к питательным средам нетребователен. Посевы из паренхиматозных органов, костного и головного мозга, брыжеечных лимфоузлов и тканей животных делают на среду Эндо или Левина методом отпечатков или наносят материал на поверхность среды пастеровской пипеткой и равномерно растирают шпателем.
Пробы фекалий (не более 0,5 г) или соскобы со слизистой оболочки кишечника от каждого животного помещают в отдельную стерильную пробирку, затем разводят в 10 мл стерильного физиологического раствора, тщательно перемешивают и выдерживают 10...15 мин при комнатной температуре для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость засевают бактериологической петлей в чашки со средой Эндо или Левина для получения изолированных колоний.
На второй день просматривают чашки и отбирают 10 колоний, выросших при посеве фекалий, и 5 колоний, выросших при посеве тканевых органов, характерных для эшерихий: круглых, с ровными краями, с гладкой выпуклой поверхностью, размером 2...4 мм, малинового цвета — на среде Эндо и темно-фиолетового — на среде Левина. Иногда у колоний отмечают металлический блеск.
Колонии пересевают на МПА и среду Минка. При поддержании на обычных средах эшерихий быстро утрачивают адгезивные факторы, при культивировании на среде Минка — сохраняют. В состав указанной среды входят буфер (рН 7,5), соли магния, марганца, хлорид железа, хлорид кальция, гидролизат лактальбуми-на, глюкоза, агар. При подозрении на отечную болезнь поросят дополнительно делают высев на кровяной МПА, поскольку штаммы, вызывающие эту патологию, обычно синтезируют бета-гемолизин.
На МПА Е. coli образует круглые, выпуклые, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии (S-форма) (рис. 95), возможно появление R-форм. Из культур, выросших на МПА и среде Минка, делают мазки и окрашивают по Граму.
Рис. 95. E. coli:
а – чистая культура; б - колония
При обнаружении бактерий, типичных по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам для Е. coli биохимические свойства не изучают, а сразу исследуют в РА на стекле с агглютинирующими антиадгезивными сыворотками, вначале с комплексной, а затем при получении положительного результата с моновалентными сыворотками. Результат реакции учитывают в течение одной минуты. Контролем служат: 1) исследуемая культура + физиологический раствор; 2) культура + нормальная кроличья сыворотка, разведенная в соотношении 1:10.
Культуры, выросшие на МПА, проверяют с сыворотками К 88, 987 Р и А 20, культуры со среды Минка —с сыворотками К 99 и F41. При положительной РА культуры относят к возбудителям эшерихиоза и на этом заканчивают их дальнейшее изучение.
При отсутствии эшерихий с адгезивными антигенами культуру идентифицируют на основании изучения ферментативных признаков. Для Е. coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы и неспособность утилизировать цитраты. У культур, идентифицированных как Е. coli, устанавливают О-серогрупповую принадлежность как косвенный показатель патогенности или изучают патогенность в биопробе на белых мышах, цыплятах.
О-Серогруппу эшерихий устанавливают следующим образом. Культуры, выращенные на скошенном МПА при 37 °С в течение 18...20 ч, смывают физиологическим раствором, переносят в сухие стерильные пробирки, прогревают в водяной бане при 100 ºС 1 ч для разрушения поверхностных термолабильных L- и В-анти-генов или автоклавируют при 120 ºС 2 ч для разрушения термостабильного А-антигена. Прогретую взвесь бактерий центрифугируют при 2000...3000 мин-1 10...15 мин и осадок используют в качестве антигена для постановки РА на стекле. Оставшуюся часть антигена разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации клеток 5*103/мл и ставят пробирочную РА.
Определение серогрупповой принадлежности культур начинают с постановки РА на стекле с групповыми поливалентными сыворотками: на чистое обезжиренное стекло наносят по капле поливалентные сыворотки. В каждую каплю петлей вносят осажденную центрифугированием культуру, и хорошо смешивают, результат учитывают в течение 3 мин. Положительная реакция характеризуется образованием мелкозернистого агглютината и просветлением жидкости. При отрицательном результате вся капля остается мутной.
Антиген, агглютинирующийся одной из поливалентных групповых сывороток, исследуют в РА на стекле с моновалентными сыворотками, разведенными в соотношении 1:10 и входящими в состав данной поливалентной сыворотки. Затем с моновалентной сывороткой, давшей положительную реакцию, ставят РА в пробирках в объеме 1 мл. Сыворотку разводят физиологическим раствором 1 : 25 до титра, указанного на этикетке: сначала готовят исходное разведение — к 2,4 мл физиологического раствора добавляют 0,1 мл сыворотки, в остальные пробирки разливают по 0,5 мл физиологического раствора, из исходного разведения переносят 0,5 мл смеси во вторую, перемешивают, из второй — в третью и т.д., из последней пробирки удаляют 0,5мл смеси, из первой — 1,5 мл. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл антигена. Одновременно ставят контроли: 1) антиген + физиологический раствор (для исключения самоагглютинации); 2) сыворотка, разведенная 1:25 без антигена (для исключения флокуляции). Все пробирки встряхивают, выдерживают в термостате при 37 °С 16... 18 ч и затем при комнатной температуре — 6...8 ч. Читают реакцию при помощи агглютиноскопа.
Результаты учитывают по общепринятому методу и обозначают в крестах (++++, +++, ++, +, —).
Биопроба. Готовят суспензию культуры в физиологическом растворе с концентрацией клеток 1 ■ 109/мл по бактериальному стандарту мутности и вводят по 0,5 мл внутрибрюшинно трем белым мышам массой 14...16 г и трем цыплятам трех-четырехне-дельного возраста (при исследовании материала от птиц). За животными ведут наблюдение в течение трех суток. В случае гибели двух зараженных мышей и более или цыплят выделенную культуру считают патогенной.
Биопрепараты. Вакцина поливалентная гидроокисьалюминиевая формолтиомерсаловая против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят.
Вакцина поливалентная против сальмонеллеза и колибактериоза пушных зверей.
Коли-протектан ВИЭВ.
Сыворотка поливалентная против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных. Сыворотки О-коли агглютинирующие.
Коли-адгезин-тест: антиадгезивные коли-сыворотки К 88, К 99, 987 Р, А 20, F41.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Изучить морфологические, тинкториальные и культуральные свойства Е. coli.
2. Изучить ферментативные свойства Е. coli.
3. Определить у культур Е. coli адгезивные антигены и О-серогруппы в РА на стекле.
Контрольные вопросы
1. Какие дифференциально-диагностические среды применяют для выделения Е. coli?
Каковы основные биохимические свойства Е. coli?
Как определяют патогенность Е. coli?