Генетическая организация фага лямбда.
Основное отличие – могут быть в 3-х состояниях:
Вирион
Вегетативный фаг
Профаг
Длинный хвостовой отросток, ДНК 2-х цепочечная, линейная внутри головки.
На 5/-конце каждой ее цепи имеется одноцепочечная последовательность из 12 нуклеотидов – липкие концы (cos-сайты). Сразу же после проникновения фаговой ДНК в бактериальную клетку, липкие концы ДНК ковалентно соединяются ДНК-лигазой клетки-хозяина и образуется кольцевая молекула.
Далее, как правило, эта кольцевая молекула бактериофаговой ДНК не приступает к транскрипции, а встраивается в бактериальную хромосому. Установлено, что гены фага λ кодируют синтез четырех регуляторных белков, один из которых репрессорный белок сI (кодируется геном сI) блокирует развитие событий литического цикла, а антирепрессорный белок Cro (кодируется геном сro), наоборот, запускает их. После поступления ДНК фага λ в клетку, выбор между литическим и лизогенным путями развития зависит от относительной скорости накопления регуляторных белков: если преобладает антирепрессорная функция белка Cro, то развиваются события литического цикла, если успевает проявиться функция репрессорного белка сI, литический цикл не осуществляется, так как белок сІ связывается с ДНК фага λ в особых участках, препятствуя транскципции фаговых генов.
Встраивание ДНК фага λ в бактериальную хромосому осуществляется согластно интегративной модели А.Кемпбелла. Этот процесс называется сайт-специфической рекомбинацией, так как встраивание ДНК фага λ осуществляется в одном и том же месте (сайте) между генами gal и bio и не зависит от rec A-системы бактериальной клетки.
За интеграцию ДНК фага λ ответственен фермент лямбда-интеграза. Этот фермент узнает две разные последовательности – одну в хромосомной ДНК (att λ), а другую в ДНК фага (b2). Затем происходит разрыв обеих молекул ДНК и последующее их перекрестное воссоединение.
После этого ДНК фага λ реплицируется с клеточной ДНК как единая структура, и все дочерние клетки при делении получают копию фаговой ДНК в составе хромосомы. Подобные клетки называются лизогенными, а ДНК фага λ в них – профагом.
Организация геномов и особенности репликации бактериофагов (ms2, r17, м13)
М13, содержащие однонитевые ДНК, кольцевые, но фаговые частицы данных фагов представлены нитевидными образованиями., прикрепляются к ворсинкам (F-ворсинкам), к верхушкам этих ворсинок и таким образом репродуцируются только в клетках, содержащих F-фактор т.е являются F -специфическими фагами. Их геном представлен кольцевой молекулой ДНК, вытянутой формой т.е в виде длинного овала. Длина фаговых частиц около 1 микрометра т.е такой же длины как клетка хозяина. Вирусная ДНК фаговых частиц покрыта белковым чехлом или белковой оболочкой, состоящей из субъединиц белковых, которые уложены наподобие черепицы на крыше. Полагают, что данные фаги могут прикрепляться не только к верхушкам F –ворсинок, но и к основанию этих ворсинок. Однако каким образом осуществляется заражение данными фагами точно не установлено. Существует представление, что они могут прикрепляться к верхушке ворсинки, а затем ворсинка сокращается и фаговая частица приближается к основанию ворсинки, где инфицирует клетку. Либо нуклеиновая кислота этих фагов двигается по внешней поверхности ворсинки к основанию ворсинки и там проникает в клетку. Эти две концепции остаются умозрительными представлениями, ибо четких экспериментальных доказательств до сих пор нет. Обладают максимум 8 генами, однако не все продукты этих генов идентифицированы
Синтез фаговой ДНК начинается с образования репликативной формы, в формировании которой участвует белок-лоцман. На второй стадии репликации генома данных фагов необходим продукт одного из генов данного фага, этот ген также, как и ген 10174, ген номер два, индуцирует разрыв в одной из нитей репликативной формы, т.е обеспечивает переход к следующей стадии репликации. Переход от тета- способа к способу по типу катящегося кольца.
На стадии репликации, образующиеся геномные молекулы данного фага (геномных ДНК) покрываются не белком оболочки, который детерминируется геном 8 у фага М13 например, а белком детерминируемым геном 5. Этот белок в виде димера субъединиц покрывает однонитевые молекулы геномной ДНК, препятствуя их использованию в виде матрицы для формирования репликативной формы, и защищает от действия нуклеаз. В таком виде, вместе с белком-лоцманом, структура, состоящая из геномной ДНК данного фага, покрытая димерами белка 5, транслоцируется к внутренней поверхности к ЦПМ, в место, где предварительно инкорпорирован продукт гена 8,(объяснение схемы) белок оболочки и включения этого белка в мембрану, модифицирует данный участок мембраны и обеспечивает в последующем возможность проникновения незрелого еще фага в данном месте во внешнюю среду. Данный фаг не вызывает лизис клетки, а его частицы высвобождаются из клетки по типу постоянного выталкивания вновь образующихся вирионов через поверхностные структуры, т.е напоминает отпочковывание вирусов животных в клетках хозяина. При этом клетка не прекращает своих синтезов, они только замедляются и репродукция фага такого типа сопровождается одновременными синтезами клеточных компонентов. Это тоже является особенностью данных фагов и отличает от всех остальных бактериальных вирусов, которые, в принципе, высвобождаются в результате лизиса. При этом многими рассматривается данное явление как аналог секреции белков бактериальными клетками.
Транслокация белка оболочки с поверхностной структуры клетки напоминает первую (имитацию?) секреции белков, ибо эти белки имеют сигнальные последовательности, которые потом отрезаются сигнальной пептидазой и с этого начала секреции белков использование(insec?)- системы. И в процессе проникновения незрелых фаговых частиц, состоящих, как вы слышали, из геномной ДНК, покрытой димерами белка 5 и прикрепленным белком-лоцманом,(?который эти димеры замещаются) белком 8 и при прохождение через поверхностные структуры создаются полноценные фаговые частицы. Возможно, что этот процесс несовсем точно охарактеризован, но полагают, что основные моменты изложены достаточно корректно с действительностью. Данные фаги нитевидные, содержащие ДНК, характеризуются непостоянством своих размеров, их частицы могут существенно отличаться по длине и по содержанию нуклеиновой кислоты. Эти фаги характеризуются еще высокой плодовитостью, урожай таких фагов на клетку достигает 10тыс. фаговых частиц на одну инфицированную бактерию и можно получить до 1г фаговых частиц на 10л фагового лизата. Нитевидные фаги удобны для некоторых целей в генной инженерии: можно получать векторные системы, которые представлены однонитевой ДНК либо двунитевой ДНК, если для этого использовать репликативные формы.
M
S2.
Чувствительные
клетки Escherichia coli AB 259 Hfr 3000, инфицированные
РНК-содержащим
фагом MS2,
продуцируют фаговые частички и
одновременно продолжают делиться,
выщепляя чувствительные клетки, способные
поддерживать новые циклы инфекции.
Размножение фага в чувствительных
клетках приводит к появлению фагоустойчивых
форм в потомстве этих клеток. Показано,
что это явление обусловлено не селекцией
предсуществующих фагоустойчивых
мутантов, а является результатом
взаимодействия между фагом и клеткой.
В отличие от обычных спонтанных или
химически индуцированных мутантов E.
coli, MS2-индуцированные
фагоустойчивые клетки представлены
генетически нестабильными формами.
Также заражают только клетки с F-пилями. Вирион этих фагов имеет форму икосаэдра. Капсид состоит из 180 молекул белка оболочки и одной молекулы белка А – белка созревания. А-белок служит рецептором, узнающим клеточную поверхность. Заражение происходит при прикреплении вириона к половому пилю. РНК входит в клетку вместе с А-белком. Эта РНК – однонитчатая, небольшая, кодирует 3-4 белка и сразу может быть использована рибосомами для трансляции (так называемая плюс-РНК). Среди вновь синтезированных вирусных белков – РНК-зависимая РНК-полимераза, которая синтезирует на матрице плюс-РНК комплементарную ей минус-РНК, а затем на матрице минус-РНК – новые цепи плюс-РНК. Из РНК, структурного белка и А-белка собираются новые вирионы. Фаг MS2 лизирует клетку. Во время размножения они выщепляют новые MS2-устойчивые формы с более выраженными изменениями в области, кодируемой половым фактором. Клетки двух конечных форм MS2-индуцированных мутантов продуцируют также новый тип фагов, преставленных ДНК-содержащими формами, которые нейтрализуются, однако, анти-MS2 сывороткой. Выщепление этих фагов подтверждает, что генетическая субстанция РНК-содержащего бактериофага способна экспрессироваться как часть ДНК-содержащей структуры.
R17 бактериофаг – сод. РНК, голый тщательно
исследованы относительно простые РНК мелких фагов R17
MS2 и т. д.; их мРНК содержит только три цистрона (ДНК
высших организмов содержат тысячи цистронов), кодирующих
А-белок, белок оболочки и РНК-репликазу (в указанном
порядке). Последовательность нуклеотидов прецистронных
участков известна только частично, но установлено, что эти участки
расположены слева от цистрона.