- •Предмет и задачи вирусологии. Связь вирусологии с другими биологическими дисциплинами.
- •Лизогенизация бактерий фазмидами.
- •Определения вируса. Отличие вируса от клеточных организмов.
- •Особенности организации и репликации вирусов растений.
- •Открытие основных групп вирусов (работы д.И.Ивановского, м.Бейеринка, ф.Леффлера и п.Фроша, п.Рауса, у.Стенли, ф.Туорта, ф.Д'Эрелля).
- •Биохимический состав вирусных частиц.
- •Принципы классификации вирусов. Основные семейства вирусов животных и человека.
- •Медленные вирусные инфекции.
- •Специальные методы выделения и изучения вирусов.
- •Генетические взаимодействие между вирусами (комплементация, рекомбинация). Негенетическое взаимодействие вирусов (интерференция, фенотипическое смешение).
- •Организация геномов вирусов. Типы днк и рнк геномов.
- •Вирусы с непрерывным и сегментированным геномами. Кодирующая способность вирусного генома.
- •Основные гипотезы происхождения вирусов и факты их подтверждающие. Возможные пути эволюции вирусов.
- •Строение вирусной частицы и функции ее отдельных структур. Систематика вирусов растений и бактерий.
- •Достижения и перспективы развития современной вирусологии
- •Методы получения фаголизатов.
- •Структура вирусных частиц: сердцевина вируса и капсид (нуклеокапсиды), оболочки вирионов и их происхождение.
- •Иммунологические методы в вирусологических исследованиях.
- •Типы симметрии вирусов (кубический, спиральный, смешанный). Взаимодействие белков и нуклеиновых кислот при упаковке геномов вирусов.
- •Функции белковых структур вирионов (рецепторные функции белков внешней мембраны, ферментные белки вирионов). Липиды и углеводы вирусов.
- •Взаимодействие фага с клеткой. Вирулентные и умеренные фаги.
- •Характеристика вирулентных и умеренных фагов.
- •Три состояния бактериофага. Механизм лизогенизации и индукции профага лямбда.
- •Бактериофаги как переносчики генетической информации бактерий. Фаговая трансдукция и фаговая конверсия.
- •Генетическая организация фага лямбда.
- •Организация геномов и особенности репликации бактериофагов (ms2, r17, м13)
- •Использование фагов в генетической инженерии в качестве векторов генетической информации.
- •Общая схема репликации вирусов (цикл одиночного развития фага, биохимия вирусной инфекции).
- •2Цепочечные. Схема.
- •Кодирующая стратегия вирусов в зависимости от организации генома. Регуляция экспрессии вирусных геномов.
- •Пути передачи вирусов животных и человека.
- •Патогенез заболеваний вирусной природы. Клеточные и организменные стадии вирусного патогенеза.
- •Распространение вирусов в организме хозяина и тропизм к определенным тканям.
- •Патологические эффекты, индуцируемые вирусами в клетках животных.
- •Самоограничивающиеся инфекции. Латентные вирусные инфекции. Медленные вирусные инфекции
- •Онкогенные рнк-содержащие вирусы. Трансформация клеток и онкогенез.
- •Онкогенные днк- содержащие вирусы. Трансформация клеток и онкогенез.
- •Иммунитет при вирусных заболеваниях. Синдром приобретенного иммунодефицита.
- •Вирусные инфекции растений. Пути передачи вирусных инфекций у растений. Методы борьбы с вирусными инфекциями растений
- •Неканонические вирусы: прионы и вироиды и механизмы их репродукции.
- •Химические антивирусные средства и механизм их действия. Интерфероны.
- •Этапы репликации вирусов, уязвимые для действия лекарственных средств. Общая стратегия поиска антивирусных средств
- •Векторы на основе вирусов животных (ретровирусов, полиомавирусов) и их использование в генотерапии.
- •Принципы картирования геномов вирусов. Физические и генетические карты.
- •Методы изучения взаимодействия вирусов с клетками (физические, биохимические, генетические).
- •Особенности строения и репликации ретровирусов. Важнейшие представители ретровирусов.
- •Очистка бактериофага. Получение чистых линий.
- •Особенности репликации вируса гепатита в.
- •Бакуловирусы насекомых. Особенности их репликации и использование в качестве векторов экспрессии в биотехнологии.
- •Новые и возникающие вирусные инфекции.
- •Организация геномов и особенности репликации т-четных и т-нечетных бактериофагов
- •Вирусные гепатиты
- •Ортомиксовирусы: репликация, биологические свойства и представители
- •Полноразмерная комплементарная кРнк (матрица для синтеза новых негативных вирионных рнк) и
- •Негативные (-) вирионные вРнк (геном для вновь синтезируемых вирионов).
- •Парамиксовирусы: репликация, биологические свойства и представители
- •Рабдовирусы: репликация, биологические свойства и представители.
- •Пикорновирусы: репликация, биологические свойства и представители
- •Герпесвирусы: репликация, био св-ва и представители
- •Арбовирусные инфекции: биологические свойства и представители
Медленные вирусные инфекции.
Медленные инфекции — это своеобразное взаимодействие определенных вирусов с организмом, характеризующееся длительным инкубационным периодом, тянущимся многие месяцы и даже годы, и последующим медленным, но неуклонным развитием симптомов заболевания, ведущим к тяжелому нарушению функций органов и летальному исходу. К медленным инфекциям относятся медленно прогрессирующие заболевания, в частности, заболевания ЦНС со спонгиоформными энце-фалопатиями у человека — куру, болезнь Крейтцфельдта — Якоба (пресенильная деменция), а у животных — трансмиссивная энцефалопатия норок и скрепи у овец.
К медленным инфекциям относят также подострый склерозирующий панэнцефалит, который вызывается вирусом кори, рассеянный склероз, амиотрофический боковой склероз и некоторые другие заболевания человека и животных.
При некоторых медленных инфекциях существенную роль играют генетические механизмы (скрепи, куру, амиотрофический боковой склероз), при других — иммунопатологические механизмы (подострый склерозирующий панэнцефалит, алеутская болезнь норок, лимфоцитарный хориоменингит).
Персистентные инфекции являются серьезной проблемой современной вирусологии и медицины. Большинство вирусов человека и животных способны персистировать в организме и вызывать латентные и хронические инфекции, и удельный вес персистентных инфекций намного превышает таковой острых инфекций. При персистентных инфекциях постоянно или периодически происходит выделение вирусов в окружающую среду, и персистентные инфекции являются основным фактором «проэпиде-мичивания» населения. Персистенция вирусов обусловливает их сохранение как биологического вида и является причиной изменчивости свойств вирусов и их эволюции.
Большую роль персистенция вирусов играет в перинатальной патологии. Вертикальная передача персистирующего вируса от инфицированной матери плоду и активная репродукция вируса в его тканях особенно опасны в первые месяцы беременности, так как приводят к аномалиям развития плода или его гибели. К числу таких вирусов относятся вирусы краснухи, простого герпеса, ветряной оспы, цитомегалии, Коксаки В и ряд других.
Борьба с персистентными инфекциями затруднена из-за отсутствия адекватных подходов к их лечению и профилактике.
Специальные методы выделения и изучения вирусов.
Современная вирусология располагает широким набором методов идентификации вирусов, к которым относятся вирусоскопические и вирусологические методы, методы серодиагностики, иммунодиагностики и молекулярно-генегические методы исследования.
Целью вирусоскопического исследования является обнаружение крупных вирионов и внутриклеточных включений с помощью светового Вирионы могут быть выявлены также с помощью электронной микроскопии.
Цель вирусологического исследования - выделение вирусов и их идентификация до уровня вида. О наличии вируса в культуре клеток судят на основании следующих показателей:
• цитопатического действия, которое выражается в изменении морфологии клеток: уменьшении их размеров и формы, пикнозе ядер, образов гигантских многоядерных клеток (симпластной деструкции монослоя клеток, наличии внутриклеточных включений
• обнаружения специфических вирусных антигенов методом иммунофлуоресценции. Препараты из исследуемого материала обрабатывают специфической иммунной сывороткой, а затем флуоресцирующей антиглобулиновой сывороткой, содержащей изотиоцианат флуоресцеина (зеленое свечение) или сульфохлорид родамина, дающий красное свечение (непрямой метод), либо меченой специфической сывороткой (прямой метод). При люминесцентном микроскопировании препаратов при одних вирусных инфекциях специфический антиген выявляется в цитоплазме в виде ярко светящихся конгломератов различной величины и формы, при других инфекциях антиген обнаруживается в ядре. На поздней стадии инфекции клеток обнаруживается свечение всей массы цитоплазмы и ядра;
• метода цветной пробы, при котором клетки культуры ткани размножаются в среде с индикатором рН. В случае нормального развития клеток происходит закисление среды продуктами метаболизма и изменение ее цвета. Репродукция вируса в культивируемых клетках нарушает их нормальный метаболизм, и цвет среды не изменяется;
• феномена гемадсорбции и гемагглютинации. На поверхности клеток, зараженных вирусом, содержащим в составе суперкапсида гемагглютинии, экспрессируются значительные его количества, и клетки приобретают способность адсорбировать или агглютинировать добавленные к ним эритроциты. В первом случае реакция учитывается микроскопически, во втором случае - визуально;
• образования бляшек под агаром. В монослое культивируемых клеток, покрытом тонким слоем агара с добавлением индикатора (например, нейтрального красного), в местах расположения погибших клеток формируются негативные или отличные по цвету колонии (бляшки);
• реакции интерференции, применяемой при отсутствии возможности использования перечисленных методов. Для этого культура клеток с исследуемым материалом дополнительно заражается лабораторным штаммом вируса, вызывающим цитопатическое действие. Считается, что морфологические изменения клеток наблюдаются только в случае отсутствия вирусов в исследуемом образце.
Идентификацию вирусов осуществляют методами серодиагностики, выявляя антитела и нарастание их титра в сыворотке крови с использованием различных иммунологических реакций, и методами иммунодиагностики, обнаруживая антигены с помощью диагностических противовирусных сывороток. Достоверные результаты серологической диагностики получают при изучении «парных» сывороток крови больных, взятых в первые дни болезни и через равные промежутки времени от начала заболевания. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания титра антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител в сыворотке по мере развития заболевания имеет диагностическое значение.
Идентификация вирусов с помощью серологических методов включает использование:
а) реакции торможения гемагглютинации (РТГА);
б) реакции задержки гемадсорбции и реакции нейтрализации (РН) с учетом результатов по гемадсорбции;
в) реакции связывания комплемента (РСК);
г) иммуноферментного анализа (ИФА);
д) реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА или РИГА).
РТГА используется для идентификации неизвестного вируса по известной специфической сыворотке или для определения специфических антител в сыворотках переболевших животных и человека по известным антигенам. Использование РСК позволяет обнаружить специфические компле-аощие антитела в исследуемых сыворотках и определить тип вируса.
Сущность метода ИФА состоит в том, что антитела диагностических сывороток метят ферментами (пероксидаза хрена, щелочная фосфатам и др.) и учет результатов реакции проводят под обычным световым микроскопом.
В РНГА один из компонентов (антиген или антитело) адсорбирован на эритроцитах, которые при образовании комплекса антиген - антитело склеиваются и выпадают в осадок. Данная серологическая реакция позволяет выявлять и идентифицировать неизвестный вирусный антиген, а также антитела и определять их титр в исследуемых сыворотках.
Молекулярно-генетические методы идентификации осуществляют с помощью полимеразной цепной реакции, гибридизации с соответствующими ДНК- или РНК-зондами.
При работе с вирусами постоянно возникает необходимость в определении точной концентрации вирусных частиц в исследуемом материале. Под инфекционной единицей (бляшкообразующей единицей, БОЕ) понимают наименьшее тестируемое количество вируса, приводящее к образованию одной бляшки (зоны лизиса). Не все вирусные частицы инфекционны. Во многих случаях большинство частиц может быть неинфекционным.
Генетика вирусов. Типы вирусных мутантов. ДИ-частицы.
Наряду с полными вирионами в процессе репродукции формируются необычные по структуре и функции вирусные частицы, которые можно объединить в три группы:
псевдовирусы, - вирусоподобные частицы, состоящие из оболочек вируса и НК хозяина.!!!!
вирусы-мутанты и
вирусы-рекомбинанты.
Псевдо- и мутантные вирионы возникают в чистых и смешанных культурах вирусов, а рекомбинантные - только в смешанных.
Вирусы-мутанты. В отличие от случайных, можно сказать кажущихся, вирионов в репродуктивных циклах вирусов закономерно появляются вирусные гибриды-мутанты (лат. mutatio -изменение), по структуре и фенотипу отличающиеся от родительского (дикого) типа, но имеющие его генетическую основу, и немутационные гибриды. К появлению вирусов-мутантов приводит спонтанный мутагенез, в основе которого лежит «ошибочное» спаривание азотистых оснований. Ошибки происходят потому, что в природе существует две таутомерные (греч. tauto -те же самые, meros - часть) формы азотистых оснований. К таутомеризму ведет постоянное перераспределение электронов и протонов в молекулах нуклеиновых кислот.
Различают 4 класса вирусов-мутантов:
1) вирусы с условно дефектными геномами;
2) ДИ-частицы, т. е. дефектные интерферирующие;
3) интеграционные вирусы с дефектными геномами;
4) вирусы-сателлиты.
Условно-дефектные вирусы несут мутантные геномы, дефектные в определенных условиях. Среди них чаще всего встречаются температурочувствительные ts- и холодочувствительные tc-мутанты, мутанты по спектру хозяев и мутанты по морфологии бляшек.
Дефектные интерферирующие вирусы, или ДИ-частицы, представляют собой вирионы, у которых отсутствует некоторая часть геномной РНК или ДНК, но структурные белки остаются такими же, как у родительских вирусов. Как правило, длина нуклеокапсидов и размеры ДИ-частиц меньше родительских диких вирусов. Репликация ДИ-частиц без родительских вирионов не происходит, но при совместном заражении клеток теми и другими она восстанавливается вследствие использования генных продуктов дикого типа, которых они сами не вырабатывают. Таким образом, для ДИ-частиц родительский вирус с полноценным геномом является вирусом-помощником (хелпером). Утилизируя для своей репликации продукты генов хелпера, ДИ-частицы вместе с тем угнетают репродукцию вируса-помощника, что в вирусологии называют интерференцией (лат. inter - взаимно, ferio - подавлять), отсюда и название - дефектные-интерферирующие.
Интеграционные вирусы с дефектным геномом - это мутанты-типы (или виды) ретровирусов подсемейства онкорнавирусов, содержащие оnс-гены (греч. oncoma - опухоль, англ. RNA -РНК), - прежде всего саркомные вирусы-гибриды, которые в процессе эволюции, как предполагают, приобрели клеточные оnс-гены. Интегрируя с клеточным геномом, ДНК-транскрипты саркомных вирусов привносят в него опс-гены и, если они попадают под действие определенной регуляции клеток, после короткого латентного периода вызывают злокачественное их перерождение.
Особое место среди мутантов с дефектным геномом занимают вирусы-сателлиты, во многом сходные с ДИ-частицами. Так же, как ДИ-частицы, они паразитируют на генных продуктах вирусов-помощников и часто интерферируют с ними, как, например, сателлит вируса некроза табака, полностью зависящий в своей репликации от одновременного заражения клеток табака его инфекционным вирусом-помощником, и вирусы-сателлиты, ассоциированные с родственными им вирусами растений, имеющими сегментированные геномы.